质粒提取常见问题

质粒提取常见问题
常见问题 1:

可能原因 :大肠杆菌老化 
建议解决方案:请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养

可能原因 :质粒拷贝数低
建议解决方案:由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

可能原因 :溶液使用不当
建议解决方案:溶液P2和P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温一段时间，直溶液变为清亮后才能使用。

可能原因 :质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)
建议解决方案:洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

可能原因 :洗脱液加入位置不正确 
建议解决方案:洗脱液应加在硅胶膜中心部位，确保洗脱液能*覆盖硅胶膜的表面以达到大洗脱效率。

可能原因 :洗脱液不合适 
建议解决方案:DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如TE和水；洗脱液pH值过低会降低洗脱效率，应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间，当用水洗脱时确保其pH值在此范围内；洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率。

可能原因 :洗脱体积太小
建议解决方案:洗脱液体积若小于30μl，则不易*浸透硅胶膜，使洗脱效率降低；洗脱液体积若超过200μl，则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。为了得到较高的洗脱效率可以适当增大洗脱液体积。

可能原因 :洗脱时间过短 
建议解决方案:洗脱时间对回收率也会有—定影响，洗脱时放置2分钟可达到较好的效果。

可能原因 :碱裂时间过长 
建议解决方案:加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。

常见问题 2:质粒纯度不高

可能原因 :混有蛋白
建议解决方案:菌体不要过量。经溶液P1、P2和P3处理并离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物，可再次离心去除。

可能原因 :混有RNA
建议解决方案:RNase A处理不*，请减少菌体用量或加入溶液P3后室温放置一段时间。若溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNaseA。

可能原因 :混有基因组DNA
建议解决方案:加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。

可能原因 :含大量核酸酶的宿主菌
建议解决方案:   宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和*0。

可能原因 :质粒的二聚体和多聚体形式
建议解决方案:是在质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。

可能原因 :乙醇残留
建议解决方案: 漂洗液洗涤后应离心尽量去除柱中残留液体，并晾干吸附柱。如果DNA已经洗脱出来，可以用酒精沉淀DNA并风干，然后再溶解。