本试剂盒采用的是双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中人P16蛋白的水平。向预先包被了人P16蛋白单克隆抗体的酶标孔中加入P16蛋白，温育；洗涤后，加入HRP标记过的P16蛋白抗体。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅与样品中人P16蛋白的浓度呈正相关。

试剂盒组成

1	标准品（16μg/ml）	0.5ml	7	显色剂A液	6ml
2	标准品稀释液	3ml	8	显色剂B液	6ml
3	酶标包被板	12孔×8条	9	终止液	6ml
4	酶标试剂	6ml	10	说明书	1份
5	30倍浓缩洗涤液	20ml	11	封板膜	2张
6	样品稀释液	6ml	12	密封袋	1个

需要而未提供的试剂和器材

1． 37℃恒温箱。

2．标准规格酶标仪。

3．精密移液器及一次性吸头

4．蒸馏水，

5．一次性试管

6．吸水纸

注意事项

1．从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差

3．建议所有标准品、样本都做双份检测。如标本中待测物质含量过高，请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再按说明书操作进行测定，计算时请后乘以总稀释倍数（×n×5）。

4．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

5．为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。

6．不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

7．底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中

标本要求

1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

操作程序

1．标准品的稀释：（本试剂盒提供原倍标准品一支，用户请按照说明自行在小试管中倍比稀释）：

8μg/ml	（5号标准品）	120μl的原倍标准品加入120μl的标准品稀释液
4μg/ml	（4号标准品）	120μl的5号标准品加入120μl的标准品稀释液
2μg/ml	（3号标准品）	120μl的4号标准品加入120μl的标准品稀释液
1μg/ml	（2号标准品）	120μl的3号标准品加入120μl的标准品稀释液
0.5μg/ml	（1号标准品）	120μl的2号标准品加入120μl的标准品稀释液

2．分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入稀释好的标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品终稀释度为5倍）。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。

3．弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。

4．每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。

5．弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。

6．每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.

7．取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

8．测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

9．根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了的，其实际浓度应该乘以总稀释倍数。

操作程序总结：

准备试剂，样品和标准品

加入准备好的样品和标准品，37℃反应30分钟

洗板5次，加入酶标试剂，37℃反应30分钟

洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色10分钟

加入终止液

15分钟之内读OD值

计算

检测范围：0.2μg/ml→10μg/ml。

规格： 96T/盒

保存： 2-8℃

有效期： 6个月（2-8℃）。

分享到：

上一篇：细胞培养常见问题分析下一篇：解析凋亡细胞的吞噬降解过程