感受态细胞相关问题

如何选择合适的宿主菌：

1、所选的宿主菌株应对所用质粒的抗生素抗性基因敏感。

2、如进行蓝/白斑筛选，宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽编码区应在染色体或附加体上缺失掉( lac Z Δ Μ15)。*0和DH5α

都能用于蓝/白斑筛选。

3、要表达重组蛋白，可使用带有可诱导的T7 RNA聚合酶基因的菌株，如BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。

4、使用pGEM载体克隆大片段时(>7-8 kb)，经转化的菌株在30℃而不是在37℃生长，更有利于复苏。作简单的亚克隆连接实验，亚克隆转化效率的感受态细胞就可满足克隆需要，更高转化效率的感受态细胞可用于作比较困难的克隆实验。为提高获得目的克隆的机会，应用尽可能高转化效率的感受态细胞(>10 8 cfu/μg DNA)。

如何筛选重组菌落：

1、可使用蓝/白斑筛选法，在涂布有IPTG和X-Gal的筛选平板上，重组菌株为白色，未转入重组质粒的菌株为蓝色。

2、可对小量提取的质粒DNA做限制性酶切，采用Solarbio公司的质粒提取试剂盒，可快速提取多个样本，而且由于提取的质粒纯度高，不会有酶切切不开影响实验的情况。

3、也可直接用细菌菌落进行PCR反应，筛选存在目的片段的重组菌落。Solarbio公司生产的PCR反应系统(MasterMix系列产品)特别适合这种方法。用灭菌的吸头挑取单个菌落到已加入MasterMix的PCR管中，加入特异引物，进行PCR扩增。扩增反应前在94℃变性5分钟，有利于细菌的裂解，提高PCR产物扩增的成功率。将所得PCR产物在琼脂糖凝胶上检测扩增带。

4、另一种筛选重组菌落的方法是用插入片段特异引物进行菌落杂交。菌落生长后转移到固体支持物如硝酸纤维膜上，作原位裂解，使质粒附着到膜上，然后用核酸引物作杂交。多用于筛选稀有克隆菌落。

如何检测感受态细胞的效价：

为确定感受态细胞的转化效率，可将一定量的超螺旋质粒转化到感受态细胞中，取一部分转化的细菌，涂布到选择培养基上，可用菌落生长单位/μg DNA，按下面的方法计算感受态细胞的转化效率。

计算公式：转化效率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量

例如：取1μl(0.1 ng/μl)超螺旋质粒转化100μl的感受态细胞。

向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板，培养，产生1000个菌落。

转化0.1 ng DNA，用SOC稀释到1000μl后，取1/10涂平板，则涂平板共用0.01 ng质粒DNA，所以转化率＝1000克隆/0.01 ng DNA

=10 5 cfu/ng=10 8 cfu/μg。

转化效率1×10 6 cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验；1×10 7cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆，有*的DNA的转化，T-克隆实验；构建文库和突变要求用的转化的效率为>1×10 8 cfu/μg DNA。