人粒细胞无形体病实验室检测方法

样本采集对象
1. 人粒细胞无形体病病例（包括疑似病例，以下同）。
2. 病例密切接触者或其他健康人群。
3. 疫源地可疑宿主动物（野生动物及狗、羊、牛等家畜）、媒介蜱。
标本种类及采集方法
1. 抗凝血。
常用EDTA抗凝管或枸橼酸盐抗凝管采集血液5ml，用于病原分离。应尽可能在病人使用抗生素前进行血液的采集。
2.非抗凝血。
用无菌真空管，采集病例、健康人群及宿主动物非抗凝血5ml，用于血清抗体及PCR检测。采集后，应及时分离血清，将血清、血球分别保存。急性期抗体及PCR检测用血液采集尽可能在发病后1周内，恢复期抗体检测标本采集少间隔2-3周。如第2份血清在1个月之内抗体升高不明显的，应建议间隔2-4周后采集第3份血液标本。
3.包涵体检测血涂片的制备。采集血液标本后，制作厚血片，进行红细胞裂解处理等。
4.媒介蜱标本的采集。
采集动物体表媒介蜱，用镊子夹取，放入铺垫有潮湿滤纸或纱布的青霉素小瓶或试管中，用纱布包紧瓶口以防止蜱爬出。实验室接到蜱标本后，先应进行种属鉴定，然后按类别分组（1-5只蜱/组），采用75%酒精浸泡30min后，用无菌蒸馏水反复冲洗3次。后进行分组研磨，研磨液用于提取DNA，进行PCR扩增。
5.有条件时，可采集活检或尸检标本，冰冻、福尔马林固定或石蜡包埋后进行实验室检测。具体方法参照病理实验室相关要求和卫生部《传染病人或疑似传染病人尸体解剖查验规定》的相关要求。
人粒细胞无形体病实验室检测
（一）包涵体的检测。
1. 血片及白细胞涂片制备
采集的抗凝血标本尽快用血球层推血片，待干燥后冷丙酮固定10min；或提取抗凝血中的白细胞并进行涂片，待干燥后冷丙酮固定10min。
2. 染色
通常采用瑞氏（Wright）染色法、姬氏（Giemsa）染色法及瑞－姬混合染色法。有条件的实验室，可使用美国CDC推荐的染色方法。
3. 染液配置方法
（1）瑞－姬染液：取瑞氏染料和姬氏染料各0.5 g，以甲醇研溶，加甲醇500ml保存，每天摇匀１次，１周后可使用。
（2）改良Mc Donald法瑞－姬染色剂：75 ml甘油（分析纯）中加入磷酸盐缓冲液（Na2HPO4 1g和KH2PO4 2g），以4 ml蒸馏水溶解，37 ℃水浴24 h溶解混匀，用滤纸过滤，保存于密封的棕色瓶中备用。上述甘油缓冲液1.5 ml加瑞－姬染色剂50 ml，混匀后备用。
4. 染色步骤
血推片或白细胞涂片分别以两种染色剂染色2 min，再加蒸馏水作用5 min，用自来水冲洗。
5. 结果观察
中性粒细胞中可见桑葚状包涵体（见图1），并注意保存相关标本，以便进行复核。
（二）血清学检测。
常用血清学方法为间接免疫荧光（IFA）法。采集急性期（发热初期，一般发病1周内）与恢复期（少间隔2-3周）双份血清。如恢复期血清抗体检测阴性，应建议医生采集第3份血液样本（间隔2-4周）。
1. 试剂
使用推荐的、经过ISO质量认证的产品。
2. 方法及操作按说明书进行。
3. 结果解释
IFA检测结果解释按说明书进行。
如果同时检测双份血清，IgG抗体4倍升高，则结果强烈支持嗜吞噬细胞无形体感染。如果急性期抗体升高，而恢复期没有升高或轻微升高，则应采集第3份血液样本（间隔2-4周）进行进一步检测。
（三）嗜粒细胞无形体核酸PCR检测。
目前，推荐使用16S rRNA基因检测方法，有条件的实验室，可进一步选用热休克蛋白基因groEL扩增方法。
1. DNA提取
用急性期、未使用抗生素的EDTA抗凝血或非抗凝血血球部分、白细胞及蜱研磨液提取DNA。后，以AE缓冲液50µl抽滤以提高回收的DNA浓度。如采用血液白细胞层提取DNA，可明显提高阳性检出率。实验时，应采集当地正常人血液同时提取DNA，作为PCR的阴性对照。
2. PCR扩增
（1）16S rRNA基因检测：16S rRNA 高度保守，是PCR检测常用的扩增靶基因，巢式PCR检测可提高检测灵敏度和特异度，采用属特异及种特异引物同时进行检测。PCR检测应分区进行，避免污染。PCR反应混合物的准备按常规进行。*轮反应采用外引物对Eh-out1和Eh-out2，DNA模板10µl（白细胞提取的DNA可适当减少）。PCR反应体系总体积为25µl或50µl（需要进行PCR测序或克隆时，应适当扩大反应体系），其它成分的浓度按常规进行。反应程序如下：
94℃ 5min
40循环：94℃ 45sec
55℃ 50sec
72℃ 1min
72℃ 总延伸 5min
第二轮反应使用2对引物分别进行巢式PCR。2对引物分别是无形体属及埃立克体属通用内引物（Eh-gs1、Eh-gs2）；以及HGA种特异性引物（HGA1及HGA2）。检测样本取*轮产物1-2µl为模板，阳性对照取0.5µl为模板。反应程序同*轮反应。
（2）热休克蛋白基因groEL扩增
与groEL基因的应用相比，16S rRNA基因的应用更为广泛，但groEL基因在不同种属间具有较大的变异性。因此，对于诊断及菌株的鉴定，groEL基因均具有重要意义。PCR检测时，反应混合物的准备按常规进行。DNA模板量同16S rRNA基因检测。巢式PCR*轮反应采用外引物对HS1及HS6。
反应程序如下：
3循环：94℃ 1min
48℃ 2min
70℃ 90sec
37循环：88℃ 1min
52℃ 2min
70℃ 90sec
68℃ 总延伸 5min
第二轮PCR引物采用HS43及HS45。检测样本取*轮产物1-2µl为模板，阳性对照取0.5µl为模板。反应程序同*轮反应。反应程序同*轮反应，但退火温度由52℃改为55℃。