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western blot样品制备注意事项及步骤

发布日期: 2019-10-18
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western blot样品制备注意事项及步骤

 

Western Blot样品制备是这个关键步骤,要求尽可能的获得所有蛋白质。所以我们在做wtstern blot实验应注意以下问题:

 

 

1:在合适的盐浓度下,应保持蛋白质的大溶解性和可重复性。

2:选择合适的表面活性剂和还原剂,破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键,使其形成一个各自多肽的溶液。

3:尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子。

4:防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰,制备过程应在低温下进行,以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰(建议加入合适的蛋白酶抑制剂)

5:样品建议分装成合适的量,然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃中保存,但要注意不要反复冻融。

 

下面我们详细介绍一下western blot实验的详细步骤。

 

一:准备工作:

 

一个水浴箱,一台超声装置,组织匀浆器

 

二:需要的溶液:

 

裂解液 Laemmli样品缓冲液

 

三:操作步骤:

 

1)培养细胞蛋白质样品的制备:

 

1:胰酶酶解后裂解:

 细胞培养80%左右密度时,以含0.05%胰蛋白酶消化,细胞经预冷的PBS漂洗3次,离心收集在离心管中,加入450μl裂解液反复吹打。

 

2:皿上直接裂解:

细胞培养80%左右密度时,细胞经预冷的PBS漂洗3次,加入450μl裂解液,细胞刮刀收集,用移液器转移离心管中,反复吹打。

以上所得的样品终用超声细胞破碎仪超声处理,超声时为5S,间歇时间为10S,功率为100-120W溶液清澈无粘稠为止,处理过程在水浴中进行,后4℃25000g离心1小时取上清或以大强度超声4次,每次15-30S,在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S,加入Laemmli 样品缓冲液(视蛋白样品浓度,以1:1或1:2的比例混合),强力混匀,样品置100℃水浴箱里水浴加热3-5分钟,10000g离心10分钟,取出清液,将其移入另一洁净试管中,此,电泳样品已准备就绪。(样品可立即使用也可以分装冻存,-20℃存放的样品可稳定保持数月)。

 

2)组织样品的制备:

 

手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中,漂洗数次,以清洁表面的血迹,将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中,按组织净重,裂解液=1:10的比例,加入相应体积的裂解液进行匀浆,离心收集上清(如有粘稠物可超声处理,具体方法见细胞培养的样品制备,也可以冷冻干燥降解核酸后,将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样 buffer中,混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解,有5分钟即可,4度离心收集。)加入Laemmli样品缓冲液(视蛋白样品浓度,以1:1或1:2的比例混合)强力混匀,样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟,10000g离心10分钟,取上清液,将其转入另一洁净的试管中,此,电泳样品已准备就绪(样品即可立即使用也可也可以分装冻存,-20℃存放的样品可稳定保持数月。)

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