文献解读|PD-1与Ad-CEA疫苗同步接种对结肠癌生长抑制的影响

结肠癌（CRC）是目前流行的癌症之一。尽管化疗和生物制剂产生积极的疗效，但晚期CRC对大多数人仍然具有致命性。错配修复缺陷的CRC对免疫检查点封锁（ICB）的反应引起了人们对将免疫疗法应用于错配修复的CRC的兴趣。癌胚抗原（CEA）是一种在多种常见癌症中表达的肿瘤相关抗原（TAA），是一种广泛应用的肿瘤疫苗免疫靶点。

癌症疫苗功效的局限性在于活化的T细胞对肿瘤的浸润程度不高，以及对那些能够转移到肿瘤的T细胞免疫检查点的上调。为改进这一问题，都医科大学附属北京世纪坛医院（都医科大学肿瘤医学院）院长助理、肿瘤治疗性疫苗北京市重点实验室主任任军教授及其团队提出了一种假设并得到证实，他们提出癌症疫苗与免疫检查点抑制剂的组合可能诱导更有效的抗肿瘤免疫反应。此前，他们曾报道过Ad-HER3疫苗接种可能会改变浸润性T细胞的表型，并对小鼠乳腺癌模型中的免疫检查点抑制产生反应，在本次研究中他们研究了抗PD-1治疗联合Ad-CEA疫苗治疗在小鼠结肠癌模型中诱导T细胞功能、细胞因子分泌和抗肿瘤免疫活性上大于任何一种单独的方法。

题目：

Impact of synchronized anti-PD-1 with Ad-CEA vaccination on inhibition of colon cancer growth

期刊：Immunotherapy

影响因子：3.028

PMID：31192764

作者单位：都医科大学附属北京世纪坛医院

目的：探讨抗PD-1抗体的加入是否能提高Ad-CEA免疫小鼠结肠癌模型的免疫原性和抗肿瘤活性。方法：植入MC-38-CEA细胞前给予Ad-CEA，然后给予抗PD-1抗体。流式细胞仪和ELISPOT检测CEA特异性T细胞反应。采用脾细胞与肿瘤细胞动态共培养的方法，分析其抗肿瘤活性。用IHC法检测淋巴细胞对肿瘤的浸润。记录肿瘤体积和总生存率。结果：Ad-CEA联合抗PD-1抗体具有较强的抗肿瘤活性。联合用药也增加了T细胞浸润，但降低了Tregs。结论：Ad-CEA疫苗联合抗PD-1抗体可增强抗肿瘤活性和免疫应答。

1. Ad-CEA的体内外转移效率

为检测Ad-CEA感染细胞和表达CEA的能力，用Ad-CEA-Luci感染NIH3T3细胞，检测其荧光素酶和CEA的表达。NIH3T3细胞的体外BLI显示荧光素酶信号呈病毒剂量依赖性增加（图1A）。在没有病毒的情况下没有检测到任何信号。CEA蛋白表达呈相似的病毒剂量依赖关系（图1B）。注射到在C57BL/6小鼠足垫处后，主要在注射部位或注射部位检测到癌胚抗原-荧光素（图1C&D）。在显微镜下观察器官的组织形态学，证实了Ad-CEA的安全性，因为在器官中没有观察到细胞病变作用。

2. Ad-CEA疫苗体内诱导抗CEA免疫应答的研究

用递增剂量的Ad-CEA免疫C57BL/6小鼠，以评估CEA特异性细胞和体液免疫反应。如图2A所示，随着病毒剂量的增加，CEA特异性T细胞的数量增加（在脾细胞中）；然而，CEA抗体的滴度在较低剂量的Ad-CEA时趋于稳定状态（图2B）。这些数据表明，抗体和T细胞应答均由AD-CEA激活，但对大刺激的剂量要求不同。

3. Ad-CEA和抗PD-1抗体联合治疗可改善结肠癌小鼠模型的预后

为了评价抗PD-1抗体联合Ad-CEA疫苗对荷瘤小鼠的疗效，作者比较了未经治疗或经Ad-CEA、PD-1抗体和PD-1抗体联合Ad-CEA疫苗治疗的小鼠的肿瘤生长情况（图3A）。通过荧光成像（FLI）（图3B）和物理测量（图3C），与其他治疗组相比，PD-1抗体与Ad-CEA合用，肿瘤的生长明显减少。联合治疗组的平均肿瘤体积为1.73cm³，未治疗对照组的平均肿瘤体积为6.42cm³。在肿瘤细胞接种后的第60天，对免疫小鼠的存活率进行监测（图3D）。与对照组或单纯Ad-CEA治疗组相比，抗PD-1单药治疗提高了小鼠的生存率。联合治疗使中位生存期延长45天。作者用H&E染色评价了各器官的组织学和细胞形态学。不同器官的HE染色均无明显的组织学异常和细胞形态学异常，提示治疗方法安全，对小鼠无毒性作用（图3S）。

4. Ad-CEA与抗PD-1联合可减少Treg细胞并增强效应T细胞反应

为了阐明PD-1阻断剂增强Ad-CEA抗肿瘤活性的免疫机制，作者先对不同组分小鼠肿瘤和脾细胞中T淋巴细胞的组成进行了研究。与对照组相比，接受Ad-CEA+抗PD-1联合治疗的小鼠的CD4+TIL总频率增加（图4A）。CD8+TILs的频率有增加的趋势（图4S-C）。在脾细胞内，与对照组相比，单独用Ad-CEA治疗的小鼠的CD8+T细胞增加，但CD4+T细胞没有增加（图）。Ad-CEA联合抗PD-1可增加CD4+T细胞和CD8+T细胞（图5B）。此外，疫苗与PD-1抗体的结合显著降低了肿瘤和脾脏中Tregs的频率（图4D和5C）。与所有其他实验组相比，用该组合物治疗的小鼠的脾细胞显示出明显更高的IFN-γ水平（图5D）和分泌IFN-r的抗原特异性淋巴细胞应答（图5F）。联合用药也能诱导肿瘤微环境中IFN-r和GranB的高表达（图4C和4E）。

PD-1阻断后，PD1+CD8+T细胞百分比增加（图5E）。相反，PD-L1在肿瘤组织中的表达在两组之间没有任何差异（图4S-D）。与肿瘤细胞共培养的图像分析显示，联合治疗后淋巴细胞的细胞溶解作用更强（图6）。这些数据表明，用抗PD-1抗体和癌症疫苗联合治疗小鼠可减少肿瘤浸润treg并增强荷瘤小鼠T细胞的效应功能。

5.Ad-CEA联合抗PD-1对荷瘤小鼠血清细胞因子的影响

为探讨Ad-CEA联合抗PD-1抗肿瘤作用的关键因素，使用Luminex多重免疫分析法对四个实验组中每组小鼠血清样品中的细胞因子水平进行了分析。与对照组相比，Ad-CEA和抗PD-1抗体的组合可显着提高血清IL-2，IL-12和CCL5的水平，并降低IL-10和TNF-α的水平（图7）。

本研究团队在小鼠结肠癌模型中证实了Ad-CEA肿瘤疫苗和抗PD-1的联合抗肿瘤作用，表明了系统性抗原特异性抗肿瘤免疫的发展。Ad-CEA和抗PD-1联合应用可以克服单一药物治疗的局限性。在晚期疾病之前进行免疫接种可能产生大的效益。