FITC荧光标记抗体该如何进行标记,有哪些标记方法?

　　在免疫学实验中，经常需要将抗体标记上酶或者荧光素，大部分科研工作者一提到FITC荧光标记抗体往往会很畏惧，主要原因是不知道如何下手，参照一些文献的方法和步骤做出来的结果往往不尽如人意，往往让实验人员畏而束手。

　　

　　FITC荧光素是目前较为常用的标记抗体的方法，FITC一般呈黄色、褐色或褐黄色粉末或结晶，性质稳定在低温中能保存数年。在碱性条件下，FITC的碳酰胺键可与抗体蛋白上的赖氨酸氨基共价结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个FITC荧光标记抗体分子上能标记15~20个FITC分子，被标记的抗体仍能保持与相应抗原结合的能力，在荧光灯源紫外线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧光，通过荧光显微镜进行观察或利用流式细胞仪分析，从而对抗原进行定性、定位或定量。

　　

　　FITC荧光标记抗体的标记方法主要有Marshall直接标记法、Chadwick间接标记法、改良标记法和透析法四种。下面，北京索莱宝科技小编将为大家主要讲解Marshall直接标记法、Chadwick间接标记法，希望可以帮助到大部分科研工作者。

　　

　　一、Marshall直接标记法

　　

　　1、抗体的准备：取提纯的Ig溶液测定蛋白质含量，置于三角烧瓶中加入生理盐水和0.5mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液，冰槽中搅拌5~10min；

　　

　　2、荧光素的准备：按每毫克蛋白质加0.01~0.02mg的FITC计算，准确称取后加入抗体溶液中；

　　

　　3、标记：边搅拌边加入荧光素，避免粉末黏附于壁上，置于4℃冰箱或冰库继续搅拌12~18h；

　　

　　4、透析：结合完毕后，先将结合物以3000r/min离心20min，除去少量沉淀物后装入透析袋中再置于pH8.0缓冲盐的烧杯中透析过夜；

　　

　　5、过柱：取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离的FITC，收集标记的FITC荧光标记抗体进行鉴定。

　　

　　二、Chadwick间接标记法

　　

　　1、抗体的准备：0~4℃下，用0.01mol/LpH8.0PBS将待标记的抗体蛋白溶液稀释到浓度为30~40mg/ml，置于三角烧瓶内放入冰槽中；

　　

　　2、荧光素的准备：按每毫克蛋白质加入0.01mg的荧光素称取，溶解于等量的3%重碳酸钠水溶液中；将抗体蛋白溶液与FITC溶液等量混合，在0~4℃中搅拌18~24h，充分搅匀；

　　

　　3、透析或过柱层析。

　　

　　这里需要注意FITC荧光标记抗体的操作过程注意避光，搅拌速度应适当避免气泡的产生；层析柱装柱注意正确操作，使柱体均匀、柱面平整，无气泡、裂隙。