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干货|ELISA实验做不好,索莱宝FAQ来帮你

发布日期: 2021-01-15
浏览人气: 800

 2020年就像一列疾驰的列车,虽然经历彷徨、迷茫,但终于驶过寒冬,驶向春天。2021带着我们美好的愿望如期而至。在新年的伊始,我们为大家送上了ELISA的一些大干货,赶紧收藏起来吧!

 

 

 

ELISA原理

 
 

酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,简写ELISA)指将抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的有无深浅定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,故可地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。

 

 

ELISA常见分类

 

01

直接ELISA

 

特点:在直接ELISA中,抗原被固定在多孔板表面,用一种针对该抗原的抗体检测,该抗体直接与HRP或其他检测分子结合。

优点:简单快速,避免交叉反应。

缺点:潜在高背景,没有信号放大。

02

间接ELISA

 

特点:固相载体包被抗原,酶标记二抗,主要用于测抗体。 

优点:使用酶标二抗增加了灵敏度,灵活度大,成本低。 

缺点:交叉反应几率升高。

用途:通过检测血清中的抗体来检测病毒,如第1,2代艾滋病诊断试剂。于免疫动物血清中抗体含量的测定。

03

双抗夹心ELISA

 

特点:使用两个特异性单抗或者1个特异性单抗和1个特异性多抗,固相载体包被抗体,酶标记特异性抗体作为检测抗体。

优点:使用两个特异性抗体检测,特异性好。

缺点:成本高。

用途:用于抗原的定量检测。

04

竞争ELISA

 

特点:包被抗体,标记抗原,样本中的抗原与酶标抗原竞争与固相抗体结合,标本中抗原含量越多,结合在固相上的酶标抗原越少,后的显色也越浅。

缺点:整体的敏感性和专一性都较差。

用途:小分子抗原或者半抗原的定量检测,当抗原材料中干扰物质不易去除或不易得到足够的纯化抗原时,多用于此方法检测;一般小分子激素及药物常用此法测定。

 

ELISA常见问题

 

Q1

为什么推荐双波长检测(450nm和630nm)?

 

A:ELISA实验终止后形成的是黄色物质,该物质需要在450nm处测定其吸光度,630nm的吸光度只是检测板子本身的吸光度,与酶标板的材质有关,测OD630可以消除各个板孔不干净等非特异性因素引起的误差。如果所使用的酶标仪不可以检测OD630也没有关系,只读取OD450的结果也可以。

数据处理时所用的矫正值,是把所有孔的OD值减去标准曲线0浓度孔的OD值,进一步计算结果。

 

Q2

CV值指的是什么?

 

A:CV值是统计学中的一个概念,中文是变异系数,可以认为变异系数和极差、标准差和方差一样,都是反映数据离散程度的值。CV值越小,说明数据的波动程度越小。在描述板内、板间实验结果是否一致时常用到CV值,其越小,说明批内及批间差越小,试剂盒质量越好。

 

Q3

标曲拟合方式的方法?

 

A:ELISA数据处理中所谓的“标准曲线”其实称为拟合曲线比较合适。标准曲线的拟合方式有多种,直线、二次曲线、三次曲线、指数、对数等虽都可用于ELISA及其它生物学反应中的曲线拟合,但都只适用于曲线的一部分,有的适用于前半段,有的适用于后半段,有的适用于中间一段,而四参数Logistic曲线拟合则对曲线的全部都有较好的适用性。目前上的免疫检测拟合方式是“四参数Logistic拟合",用这种拟合方式往往能够比较的反映浓度和吸光度的曲线关系,从而进一步比较正确地获得样品中待测物质的浓度值。

建议用专门的软件进行数据处理,这样可以快速、准确地计算出结果。

 

Q4

明确标明种属的试剂盒可以用来检测其他

种属的样本吗?

 

A:ELISA试剂盒严格区分种属,一般不推荐跨种属检测,不同种属的同一个指标同源性相差可能会很大,抗体的特异性要求比较高,不同种属样本与抗体结合能力会有很大差别。

 

Q5

ELISA试剂盒只能检测血清、血浆、细胞

上清液吗?

 

A:通常我们可用于ELISA检测的样本是有多种类型的,包括血清、血浆、细胞上清等常规样品,而对于尿液、细组织匀浆液、细胞裂解液等样品,目前市面上很多厂家的产品都没有相关的验证数据,理论上可以检测,客户如有需要可以自行测试。需要注意的是,不同类型的检测样本前期的处理方法是不一样的。样品中含有影响生物活性的物质会影响检测结果。

 

Q6

试剂盒在使用前要室温放置30min,目的

是什么?

 

A:ELISA试剂盒对于温度的要求比较严格,温度是ELISA结合反应的重要影响因素,这样做主要是为了使试剂温度一致,在后面的温育反应步骤中,能使反应微孔内的温度能较快地满足测定要求。

 

Q7

样本收集后不能及时检测,低温保存可以

放多久?

 

A:样本收集后24之内进行检测,放在4℃冰箱即可。如果样本收集后不能立即检测,需将样本置于低温冰箱中,样本3个月内检测可于-20℃保存,若需存放时间更久,需要-80℃冰箱保存。

 

Q8

样品反复冻融影响大吗?

 

A:样品反复冻融对蛋白影响非常大,能导致蛋白降解,非常不建议反复冻融样品。一般蛋白含量丰富的样本例如血清/血浆反复冻融1-2次,对于检测结果影响不是非常大,但是其他类型的样本,例如细胞上清液、肺泡灌洗液,反复冻融会使蛋白降解严重,对检测结果影响非常大。

 

Q9

生物素化抗体和酶结合物,稀释后没用完,

可以再用吗?

 

A:稀释后的生物素化抗体和酶结合物建议在当天用完,放置时间太长可能会影响其活性。可根据自己实验所需用量进行配制,不建议过量配制。

 

Q10

变异系数(CV)较大的原因?

 

A:

Q11

标准曲线较差?

 

A:

 

Q12

高背景或阴性对照值偏高

 

A:

Q13

显色信号弱

 

A:

 

Q14

无显色信号

 

A:

 

Q15

标曲佳但样品孔无信号

 

A:

 

索莱宝ELISA试剂盒产品优势 

 

 

精选原料:国外血统,多级筛选,品质;

技术工艺:专业制造,严格执行全面规范的SOP;

严格质控:批批质检,数据真实,可追溯与重复;

种类齐全:400+小物种,500+常见物种,共1000多种;

应用广泛:检测分析物全面覆盖癌症,信号转导等各领域;

性能:线性范围广,高灵敏度,高特异性,高重复性,高均一性;

品质:与国外进口同类产品平行性高,符合率≥99.95%。

 

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