文献解读|级联响应型纳米平台抑制乳酸外流增强肿瘤化学免疫治疗

1.响应GSH降解的纳米颗粒的合成与表征

首先在前人研究的基础上合成了固体二氧化硅纳米颗粒（记为sSiO₂ NPs）。之后，以sSiO₂ NPs为基础合成了中空介孔有机硅纳米颗粒（命名为HMONs）。BSA用于阻断装载在HMONs中的HCPT（HMONs@HCPT-COOH），以降低纳米颗粒对正常细胞的细胞毒性。实验表明，BSA能稳定地在HMONs表面组装。

为了有效的加载siMCT-4，PEI被装载到HMONs@HCPT-BSA-COOH的表面。后，将PEG-CDM引入HMONs@HCPT-BSA-PEI表面，延长血液循环时间。实验表明成功合成了GSH降解中空介孔有机硅纳米胶囊和PEG化PEI功能化BSA封阻的HMONs（HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG）。

2. 响应GSH的药物释放和纳米颗粒吞噬

由于实体瘤的这种异常代谢，肿瘤细胞内会积累高剂量的还原性谷胱甘肽。基于实体肿瘤的特点，设计了一个纳米药物和siRNA传递系统，其具有弱酸性和GSH响应性（HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4）。HCPT释放结果表明（图2A），纳米平台具有良好的GSH响应能力。采用流式细胞术（FCM）（图2B）和激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）（图2C，D）对纳米颗粒的吞噬作用进行表征。由于CDM键的断裂，暴露PEI可以增强B16F10的细胞摄取功效。PEG-CDM组对肿瘤微环境的弱酸反应并暴露PEI组。B16F10细胞呈现强正电荷促进吞噬作用，这与其他研究一致。在肿瘤细胞中，纳米药物和siRNA传递系统持续释放化疗药物HCPT和siMCT-4，用于协同肿瘤化疗免疫治疗。

通过琼脂糖凝胶阻滞试验验证纳米颗粒负载siRNA的效果。结果表明，当纳米颗粒与siRNA的重量比（w:w）为10：1时，siRNA可以*负载。终的重量比为20：1，以供进一步研究。通过免疫荧光（图2E）和Western blotting实验（图2F）验证了负载siMCT-4的纳米颗粒对B16F10细胞中MCT-4表达的影响。结果表明，与其他组相比，负载siMCT-4的纳米颗粒能有效抑制MCT-4的表达。

3.乳酸对体外巨噬细胞极化的影响

通过RAW264.7细胞与肿瘤细胞（B16F10细胞和4T1细胞）共培养实验，验证乳酸对体外巨噬细胞表型极化的影响（图3A）。Western blotting检测结果表明，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4显著沉默了B16F10细胞和4T1细胞中MCT-4的表达（图3B）。经HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4处理后，共培养液（RAW264.7细胞与B16F10细胞共培养）中的细胞外乳酸含量较其他处理低（图3C）。同时，B16F10细胞的胞内乳酸含量高于其他处理（图3D）。以上结果与RAW264.7细胞与4T1细胞共培养模型的结果高度一致。上述实验结果证明，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4可以抑制MCT-4的表达，并进一步抑制B16F10细胞和4T1细胞的乳酸外流。

流式细胞仪检测M1型标记物CD86和M2型标记物CD206的表达。结果提示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4组M1型巨噬细胞比例明显增加。HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4+forskolin组CD86表达下调，CD206表达上调。HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4+乳酸组也表现出与HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4组相反的趋势，说明培养基中的乳酸在巨噬细胞表型极化中起着重要作用。此外，与仅用DMEM培养基组相比，B16F10或4T1细胞共培养组中CD86和CD206的表达略有上调（图3E，F）。采用免疫荧光法检测不同处理后CD86和CD206的表达情况。从CLSM图像中可以看到HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4组CD86表达明显增加，CD206表达明显减少（图3G，H）。其他组的结果及相关荧光定量统计（图3I，J）与FCM检测结果趋势一致。以上结果表明，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4在体外通过抑制乳酸外流显著诱导RAW264.7细胞表型向M1型极化。

4.纳米平台的细胞活力和细胞毒性评价

本研究中，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4在体外可显著抑制B16F10和4T1细胞活力，诱导肿瘤细胞凋亡。Western blotting检测不同处理后细胞凋亡相关蛋白的表达。WB结果显示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4+Forskolin和HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDMPEG@siMCT-4组显著诱导B16F10细胞和4T1细胞中Bax的表达，但Bcl-2的表达受到抑制（图4A），蛋白灰度定量统计结果一致（图4B）。结果显示，两组均具有较高的细胞毒性，可显著诱导肿瘤细胞凋亡。与其他组相比，也显著抑制了B16F10和4T1细胞活力（图4C）。为了进一步研究负载HCPT和siMCT-4的纳米平台的细胞毒性，作者使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒确认不同处理后的细胞毒性（图4D）。流式细胞术检测结果提示两组均能诱导肿瘤细胞凋亡，且有时间依赖性。HMONs-BSA-PEI-CDM-PEG具有轻微的细胞毒性。

5.利用纳米平台通过抑制肿瘤细胞内乳酸外流激活巨噬细胞M2到M1极化和恢复体内T细胞活性

为了验证MCT-4在体内沉默的有效性，我们在各种治疗后处死B16F10或4T1荷瘤Balb/c小鼠。对B16F10肿瘤组织（图5A）和4T1肿瘤组织（图5H）进行Western blotting检测MCT-4的表达。结果显示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4+Forskolin和HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4组抑制了MCT-4的表达。此外，通过检测肿瘤组织细胞中乳酸含量和TME中乳酸含量，证明通过抑制乳酸在体内的外流，肿瘤细胞中乳酸含量增加，TEM中乳酸含量降低。从相关结果（图5C，D，I，J）中，作者发现HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM@siMCT-4+Forskolin和HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4组显著抑制了B16F10和4T1荷瘤小鼠的乳酸外流量。

接下来作者研究了抑制乳酸外流对TAM表型极化和恢复体内CD8⁺T细胞活性的影响，结果表明HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4组明显降低了M2型TAMs的百分比（图5D，F，K，M），同时增加了M1型TAMs的能力（图5E，F，L，M）。免疫荧光法检测B16F10肿瘤组织中TAM标记物（CD11b）、M2型标记物（CD206）和M1型标记物（CD86）的表达。HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4组抑制了CD206的表达，诱导了CD86的表达，这与B16F10肿瘤组织的FCM检测结果一致。检测了B16F10或4T1肿瘤组织中Treg细胞的百分比，验证了工程化的纳米平台清除免疫抑制TME的效率。以上结果证实HMONs@HCPT-BSA-PEICDM-PEG@siMCT-4在体内通过抑制乳酸外流的作用，有效地将TAMs的表型从M2型极化为M1型，降低Treg细胞的百分比，恢复CD8⁺T细胞的活性。

 6.体内对肿瘤组织免疫应答的恢复及对肺肿瘤转移的抑制

进一步讨论抑制乳酸外流在免疫抑制TME和激活体内免疫应答中的作用，相关结果表明，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4组的相关免疫细胞比例明显高于其他组（图6A，B），证明HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4在体内通过抑制乳酸外流，显著缓解免疫抑制TME，激活免疫应答。采用免疫荧光法检测B16F10肿瘤组织中的免疫促进因子（IFNγ、TNF-α）和免疫抑制因子（Arg1、TGF-β），分析其抗肿瘤作用机制。根据CLSM图像，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4组显著诱导免疫促进因子表达（图6B），降低免疫抑制因子表达（图6D）。对应的荧光定量统计（图6H）与FCM和IF检测结果趋势一致。上述结果表明，在免疫抑制TME中，乳酸是主要的免疫调节因子。通过抑制乳酸外流可以有效地将免疫抑制型肿瘤转化为“热”型肿瘤，在体内实现免疫应答。

有研究表明，免疫抑制TME中乳酸含量与肿瘤细胞肺转移密切相关。有报道使用Balb/c小鼠肺转移模型来证明HMONs@HCPT-BSA-PEICDM-PEG@siMCT-4对B16F10细胞和4T1细胞肺转移的影响（图6C）。经不同处理后，肺组织图像显示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4组明显抑制肺转移，减少了B16F10细胞（图6D，E）和4T1细胞（图6F，G）肺转移结节的形成。此外，H&E染色结果还显示HMONs@HCPT-BSAPEI-CDM-PEG@siMCT-4组B16F10细胞和4T1细胞通过抑制乳酸外流转移到肺组织。

7.体内抗肿瘤效能

利用B16F10和4T1荷瘤小鼠研究HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDMPEG@siMCT-4在体内的抗肿瘤效能（图7A）。从图7B的荷瘤图像来看，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4组与其他组相比，肿瘤生长明显受到抑制。相关肿瘤体积（V/V₀）结果（图7C）与荷瘤小鼠图像趋势一致。肿瘤组织重量结果显示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4组体内抗肿瘤效果好（图7D）。进一步研究体内肿瘤细胞的凋亡情况，图7E和F证实HMONs@HCPT-BSAPEI-CDM-PEG@siMCT-4组明显诱导体内肿瘤细胞凋亡。相关的荷瘤生存率结果表明HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDMPEG@siMCT-4具有显著的抗肿瘤效果，并显著延长荷瘤小鼠的生存时间。

接下来揭示了HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4对Balb/c小鼠的生物相容性和细胞毒性，荷瘤小鼠的体重证明HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4在体内具有良好的生物相容性。此外，HE染色图像显示HMONs@HCPT-BSAPEI-CDM-PEG@siMCT-4对主要脏器无毒副作用，而HCPT组肝脏毒性较轻，这与其他研究一致。

为了研究停止治疗21天后肿瘤的复发，给4T1荷瘤小鼠用药。从图7E中4T1荷瘤小鼠的图像来看，与其他组相比，HMONs@HCPT-BSA-PEICDM-PEG@siMCT-4组能显著抑制肿瘤生长。相关肿瘤体积（V/V₀）结果（图7F）与荷瘤小鼠图像趋势一致。肿瘤组织重量结果显示，HMONs@ HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4组抗肿瘤效果优于其他组（图7G）。相关的肿瘤体积（V / V₀）证明了HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDMPEG@siMCT-4组在停止治疗后激活了免疫反应而显著抑制肿瘤复发。从这些结果来看，HMONs@HCPT-BSAPEI-CDM-PEG@siMCT-4在体内表现出良好的抗肿瘤效果，明显延长荷瘤小鼠的生存时间，并有效抑制肿瘤复发。