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PCR定量试剂盒灵敏度的验证方法概述

发布日期: 2022-04-18
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  PCR定量试剂盒在工业中的应用主要存在一个方法验证的问题,尤其是灵敏度的验证。灵敏度不够,就会发生漏检。另外,PCR所直接面对的样本是DNA,而非病原菌或DNA,因此还需要做DNA抽提,这也是要注意的。
  
  药典规定,生物药厂的主细胞库、工作细胞库、生产终末细胞、检定细胞、病毒种子批和病毒收获液、细胞培养相关材料如培养基、胰酶、临床治疗用干细胞和免疫细胞等,都必须不含支原体。
  
  因此,如能采用PCR检测支原体并替代药典方法,还是能节省很多时间和精力。但PCR定量试剂盒的验证需要完整的方法。灵敏度验证是一个重要方面。灵敏度不够,就会发生漏检。
  
  具体验证可使用10CFU的支原体灵敏度标准品,它一般为冻干粉形式,需要用待测样本的样本基质(需保证里面不含支原体)来复溶,再进行DNA抽提以及PCR检测。如检测的电泳有条带,或者qPCR检测后的Ct值小于40,即表明检测成功。
  
  因此,在选用支原体PCR法检测来替代药典方法时,需要考虑如下两个方面:
  
  一是要使用符合欧洲药典要求,经过验证的支原体检测试剂盒,二是自我验证,即确认所用的样本基质对于该试剂盒方法是合适的,并且操作过程是正确的。小规模的室内验证通常需要采用三个不同批次的试剂盒,然后加入10CFU的标准品,做复孔(通常是8个复孔),并且至少选择3个支原体物种进行验证。
  
  有的支原体标准品厂家会提供CFU与基因拷贝数的比值,以方便二者的换算。因为10CFU只能确定PCR定量试剂盒能够达到的检测限在10CFU以下,但无法具体确定灵敏度的数值。带DNA拷贝数标定的基因组DNA标准品则可进一步确定检测限的数值。
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