经过驯化相关负选择的两个基因簇及其正调控因子SlMYB13控制番茄中的酚酰胺

1.通过代谢组全基因组关联研究(mGWAS)鉴定出两个酚酰胺生物合成基因簇

2. BGC11和BGC7对番茄中酚酰胺多样性的贡献

作者为探究BGC11和BGC7核心酶在番茄中的功能，构建了过表达SIAT1.1、SIAT1.2、SIAT1.3、SIDH29和SICV86的转基因番茄株系。代谢物分析显示，SIAT1.1/1.3-OE株系中单酰基化Put衍生的酚酰胺增加（图2A-B），而二酰基化的Put衍生酚酰胺在SIAT1.2-OE株系中过度积累（图2C）。随后研究发现CRISPR-Cas9生成的SIAT1.2突变株系(SIat1.2-CR)中二酰化酚酰胺减少，尤其diCou-Put减少近3倍（图2D），表明BGC11增强了Put衍生酚酰胺多样性。类似地，SIDH29-OE株系中单酰基化Spd衍生酚酰胺增加（图2E），而SICV86-OE株系中二酰基化Spd衍生酚酰胺积累更多（图2F），再次表明了Spd衍生酚酰胺的多样化。

为研究转运蛋白SIDTX29如何影响酚酰胺代谢，进一步使用LC-MS测定了酚酰胺积累。结果表明SIDTX29-OE品系中Caf-Spd、Fer-Spd和diCaf-Spd积累明显增加（图2G）。BGC7的四个基因共表达使烟叶中的Caf-Spd含量增加了35.4倍（图2H）。单独或共表达也导致Caf-Spd的积累显著增加（图2H）。研究表明BGC11与Put衍生的酚酰胺，BGC7与Spd衍生酚酰胺的生物合成与修饰、运输的关系（图2I）。以上发现强调了BGC11和BGC7这两个基因簇在番茄酚酰胺多样性中发挥的关键作用。

3. SlMYB13直接正向调控BGC11和BGC7中的基因表达，以促进酚酰胺的积累

接下来，作者通过分析两个BGC基因簇的表达谱，发现它们主要在根、花、叶、茎、果实中高度表达。荧光定量PCR 验证了二者的同步表达（图3A）。共表达网络分析表明SIMYB13与BGC7和BGC11在花、根中的表达模式的相关性较强。此外，SIMYB13和基因簇均因干旱胁迫和脱落酸(ABA)处理而上调，表明存在胁迫响应调节机制（图3B和3C）。

为了描述SIMYB13与BGC11和BGC7的12个基因之间的相互调控作用，进一步通过酵母单杂交试验证实了SIMYB13与基因启动子的直接相互作用（图3D）。SIMYB13-OE系显示BGC7和BGC11基因表达增加，Put衍生和Spd衍生的酚酰胺水平更高（图3E）。相反，SImyb13-CR系显示12个基因的表达减弱，且酚酰胺含量减少（图3F）。综上所述，SIMYB13正向调控番茄中的BGC11和BGC7，突出了其在促进酚酰胺积累中的作用。

4. BGC11、BGC7和SIMYB13通过促进番茄中酚酰胺的积累提高耐旱性

在进一步的研究中，作者使用表达SIMYB13和核心BGC基因的转基因品系开展干旱胁迫实验。结果表明SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE、SICV86-OE和SIMYB13-OE品系比WT植株更耐旱，其中SIAT1.2-OE特别耐旱（图4A和4B）；相比之下，SImyb13-CR系比WT植株对干旱胁迫更敏感（图4C）。在水分充足或干旱胁迫条件下，SIat1.2-CR系和WT植株之间没有显著差异（图4D-4F）。SIMYB13-OE、SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE和SICV86-OE系在干旱条件下比WT植株表现出更高的存活率和更高的相对含水量，而SImyb13-CR系则表现出相反的模式（图4E和4F）。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定和丙二醛(MDA)积累试验表明，与WT植物相比，SIAT1.2-OE和SIMYB13-OE植物的活性氧(ROS)清除能力增强，MDA积累减少（补充图）。这些结果表明BGC11、BGC7和SIMYB13可以增强番茄的耐旱性。

作者通过分析转基因植株在干旱胁迫下的ABA水平发现，SIMYB13-OE、SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE和SICV86-OE品系的ABA积累高于WT，而SImyb13CR品系中ABA积累较少（图4G）。通过RT-qPCR进行检测，结果表明，干旱胁迫后，ABA合成和信号转导相关基因在过表达品系中表达增加，而在SImyb13-CR中减少（图4H-I）。SIat1.2CR与WT在ABA含量或基因表达上无显著差异。因此，BGC11、BGC7和SIMYB13可以影响ABA含量。

进一步分析结果表明，干旱条件下SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE等植株中酚酰胺（如Fer-Put等）积累高于WT，而SImyb13-CR较低（图4J）。外源Fer-Put处理WT植物后，ABA含量显著升高（图4K），且相关基因表达也增加（图4L-M）。这表明酚酰胺积累（受BGC11、BGC7和SIMYB13调控）通过增强ROS清除能力和增加ABA来增强番茄耐旱性。

5. 番茄驯化和改良过程中BGC11、BGC7和SIMYB13的自然变异

接下来，为探究BGC11、BGC7和SIMYB13的进化历史，作者比较了三个番茄亚组之间的核苷酸多样性(π)。在变异分析中，作者在SIMYB13的CDS区域内发现了一个与Fer-Put、diCou-Put和diCaf-Spd相关的非同义突变。基于该变异，番茄种群被分为两个单倍型组，即SIMYB13-T^HapA和SIMYB13-G^HapB。SIMYB13-G^HapB的Fer-Put(P = 2.36×10^-9)，diCou-Put（P = 3.15×10^-5）和diCaf-Spd（P = 2.15×10^-9）浓度显著高于SIMYB13-T^HapA，且在番茄驯化和改良过程中频率逐渐降低（图5A）。

同时，作者在烟叶中瞬时表达了SIMYB13-T^HapA和SIMYB13-G^HapB，并发现SIMYB13-G^HapB中酚酰胺的积累量更大（图5B）。此外，表达这两种单倍型的SIMYB13-OE株系比WT植株表现出更强的耐旱性；特别是SIMYB13-G^HapB，在干旱条件下保持了更强的ROS清除能力以及更低的MDA水平（图5C和5D）。以上结果表明，SIMYB13-G^HapB可以调节酚酰胺的积累，并在番茄驯化和改良过程中经历了负向选择。

基于上述结果，作者将六个基因单倍型组合为HapA、HapB和HapC三组。结果显示，HapB品种的酚酰胺积累量远高于HapA（图5F、G），耐旱性也更强（图5H）。经RT-qPCR和代谢组学分析证实，HapB中这些基因的转录本上调，酚酰胺积累量增加（图5I）。以上发现强调了HapB单倍型与酚酰胺含量增加的关联，HapB的消耗可能是导致番茄耐旱性降低的因素之一。

6. BGC11和BGC7在植物中的进化史

为了进一步探索BGC11和BGC7基因的进化历史，作者对30个具有进化代表性的物种进行了比较基因组分析。分析表明，发现CPA基因在藻类中存在且保守，而4CL、C3H和UGT基因源于陆生植物祖先。BGC11和BGC7核心基因仅存在于陆生植物中。BGC11和BGC7基因聚集在茄科植物中，马铃薯和番茄基因共线性较强。这些发现突出了酚酰胺BGCs在植物适应陆地环境及茄科植物保护中的重要性（图6）。

考虑到物种的系统发育和全基因组复制的历史，作者提出了一个进化模型来解释BGC11和BGC7基因簇的起源。1910万年前基因组重排影响BGC11，620万年前串联重复影响BGC7。这些发现表明，基因簇的形成和多样化依赖于结构变异和基因得失。在番茄驯化中，BGC11、BGC7和SIMYB13的HapB受负向选择，导致酚酰胺含量下降，影响耐旱性（图7）。