同位素标记物|解锁生命过程的密钥

稳定同位素标记物是研究代谢的有力工具，越来越多地用于体内代谢研究，稳定同位素标记物在体内代谢研究中已经解决了许多生物学问题，如：代谢路径的确认、疾病机理的探索、新调控原理的发现、新治疗靶点及生物标志物的确认、新诊断方法的实施及个性化治等^[1]。

小分子稳定同位素标记物是指利用稳定同位素（如 2H、13C等）替代化合物中原有的常见同位素（如 1H、12C），从而被标记的、相对分子质量较小的有机或无机化合物。这种同位素标记物核心特点是化学性质与未标记的物质几乎保持一致和因质量不同导致的物理性质的差异，具有无放射性安全环保和可被质谱等仪器检测到的优势。

原理与用途

其基本原理基于以下两个关键点：

化学性质一致性原理

由于稳定同位素（如 13C 和 12C）的电子层结构相同，因此由它们构成的标记物与其未标记的对应物具有几乎相同的化学和生物化学行为。这意味着它们在色谱分离中的保留时间、在生化反应中的酶促反应速率、与受体的结合能力等都是相同的。

质量差异的可检测性

虽然化学性质相同，但含有重同位素的分子比未标记的分子质量更大。

这种质量差异虽然很小，但可以被高精度的质谱仪精确地区分和检测。质谱仪能够根据质荷比（m/z）将“轻"标分子和“重"标分子分离开，并分别对它们的信号强度进行定量。

图1  13C-谷氨酰胺纳入三氯胺酸循环^[2]

1. 代谢流分析

这是常用的应用之一。通过给细胞、组织或生物体喂食特定位置被标记的底物（例如，13C-葡萄糖），可以追踪标记原子在代谢网络（如糖酵解、三羧酸循环）中的流动路径和速率。可以用于研究代谢途径的活跃程度、发现新的代谢通路、在疾病（如癌症）中代谢重编程的机制等。

2. 绝-对定量分析

在质谱-based的定量分析中，将已知量的稳定同位素标记（作为内标）加入到含有未知量目标分析物的样品中。由于稳定同位素标记和分析物在样品前处理（如萃取、衍生化）和色谱分离过程中的行为一致，但能被质谱区分，因此可以通过稳定同位素标记的回收率来精确校正分析物的损失。最终，通过比较两者的质谱信号强度，即可精确计算出分析物的绝-对量。

3. 药物代谢动力学研究

在药物开发中，使用稳定同位素标记的药物分子来研究ADME过程，药物被身体吸收的程度、药物在体内的分布情况、药物被代谢成哪些产物和药物及其代谢物被排出的速度和途径。使用稳定同位素标记可以清晰地将给药后的药物分子与内源性物质或代谢产物区分开来，并进行精确定量。

4. 作为内标

即使在非定量的筛查中，稳定同位素标记也常被用作保留时间内标或过程监控内标，以校正仪器响应的漂移和样品制备过程中的变异，提高数据的可靠性和重复性。

稳定同位素标记物——优秀示踪剂

常用的示踪剂有稳定和放射两种同位素示踪剂，稳定同位素示踪剂因其标记方式灵活多样、示踪时长不受半衰期限制、给药方式多样及示踪通路研究较多等而受到体内代谢研究实验的追捧。

稳定同位素示踪剂应用较多的为含氘 (²H)、碳-13 (¹³C)、碳-15 (¹⁵N)、氧-18 (¹⁸O) 等的同位素标记物，全标记的示踪剂具有作为全局示踪剂的潜力目前广泛用于代谢研究中，它们可以一次将标记转移到多个下游途径中，研究多个通量，如全 ¹³C 标记的葡萄糖 (D-Glucose-¹³C6) 和谷氨酰胺 (L-Glutamine-¹³C5) 等，通过给药体内，可分析下游代谢产物，找出上下游代谢途径及其它们的内在关系、代谢产物的组成和含量等，甚至研究细胞代谢的动态变化。

图2  通过¹³C标记确认OxPPP 和 Non-OxPPP 代谢途径^[3]

而特定位置标记的稳定同位素示踪剂因其在特定位置的同位素原子会转移到特定的代谢物中，对研究特定通路方面具有明显优势，目前也被广泛应用于体内代谢研究汇中，如有 [1-¹³C]-glucose 和 [1，2-¹³C]-glucose 在研究葡萄糖是参与的有氧化磷酸戊糖 (OxPPP) 还是非氧化磷酸戊糖 (Non-OxPPP) 途径中发挥了重大作用[3]。

如何选择合适稳定同位素示踪剂——体内代谢

1、选定标记策略

测通量/速率 → 单一位置标记

例：测糖酵解通量，用 13C-1-葡萄糖。

探索未知途径/全局视图 → 均匀标记

例：探索葡萄糖的全面命运，用 13C6-葡萄糖。

区分相似分支途径 → 位置特异性标记

例：TCA循环与回补反应，用 13C-1,2-葡萄糖。

2、选定标记原子

碳代谢（糖、脂、氨基酸） → 13C

脂质合成/氧化还原 → 2H

蛋白质/氨基酸代谢 → 1?N

能量代谢/ATP合成 → 1?O

3、选定合适给药方式

口服：方便，模拟天然摄食。但需考虑首过效应和肠道微生物的干扰。

静脉注射：可快速达到稳定血药浓度，提供清晰的动力学起点。

腹腔注射：折中方案，吸收较快且操作相对简单。

输注：用于稳态代谢流分析，通过持续输注使体内示踪剂达到“同位素稳态"。

4、上机检测

仅能测标记/未标记 → 低分辨率质谱 → 选择简单标记。

能测同位素标记模式 → 高分辨率质谱 → 可选择均匀或位置特异性标记。

小提示

标记物性质：要求稳定（在体内不分解、不交换）与惰性（不干扰正常代谢）。

代谢路径：要求清晰可控，需预先明确其代谢途径与产物，确保数据可解读。

实验操作：方案需具体可行，包括递送方法、剂量、样品处理与数据分析方法。

经济成本：预算需提前规划，因标记物价格昂贵，需根据实验规模权衡策略与总量。

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