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Western/ELISA显色底物大盘点

发布日期: 2015-12-01
浏览人气: 5789

一、 HRP 辣根过氧化酶是常见的酶促发光或显色的交联酶,由于HRP比活高、特异性更强、分子量小(40kD)、稳定性好和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物种类有不少,主要可以分为化学发光底物和生色底物2大类:

1. 化学发光底物:

化学发光底物主要考虑的是:发光信号强弱——发光信号当然越强越好,强发光信号持续的时间也是越长越好,还有就是背景低灵敏度高。

原理:试剂中的发光物在辣根过氧化物酶的作用下发生氧化降解,并发射波长为428nm的光,此光可经x光胶片(放射自显影片)感光记录下来。

常用的化学发光底物有ECL,在ECL底物中,含有H2O2和鲁米诺,在HRP的作用下,发出荧光来。

索莱宝ECL Plus

产品简介:索莱宝ECL Plus荧光检测试剂采用*的发光底物系统,具有灵敏度和高信噪比,可检测出10-100 fg的微量抗原,检测灵敏度高出普通ECL产品100倍以上;同时该试剂极其节省抗体(一抗1:2000-1:6000,二抗1:4000-1:10000),产生的非特异背景非常低。发光迅速,荧光可使X感光胶片感光达12小时以上,特别适用于痕量蛋白或核酸检测。

产品组成:以100ml规格为例,含50 ml 溶液A和50 ml 溶液B。根据用量,使用前混合。用途:用于HRP标记抗体的Western Blot和HRP标记探针的核酸杂交。

安全性:无特殊毒性,按普通化学品处理。

产品储存:4 ºC避光储存1年。25 ºC室温放置数周不影响质量。

同时索莱宝还拥有多种ECL化学发光检测试剂盒,更大程度的方便了客户的实验过程。

索莱宝ECL化学发光试剂盒

产品内容:
1. 封闭试剂: 30g(可配制 400ml)。
2. 10 倍浓缩抗体稀释液50ml。
3. HRP 标记二抗0.3ml,效价 1: 500-1000。
4. ECL 显色液,25mlA+25mlB。
产品保存:-20℃避光密闭保存,一年有效。若经常使用,可将封闭试剂,抗体稀释液和 ECL 显色液存放于 2-8℃以方便使用。

HRP的生色底物显色有DAB, AEC和TMB等(而得到可溶性产物的底物如OPD,ABTS等则适用于ELISA)中,与化学发光法中的酶促基团发光不同,底物显色主要是利用底物在有HRP和过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累,这一过程检测WB的结果。

HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料,通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
HRP
DH2+H2O2────→D+2H2O
供氢体的种类很多,形成的产物特点不一。

  • DAB(3.3-二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物,并有电子密度,故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物,灵敏度高,特异性好,缺点就是需要现配现用,显色后光照数小时会褪色,不能*保存,需要拍照记录,而且有毒。

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  • 目前用得较广泛和较满意的供氢体是:OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色,后者产物为蓝绿色,二者的可溶性均好,在避光处颜色稳定,空白可近于无色。

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TMB双组分是将A、B液分开放置,现用现混;TMB单组分则将A、B液预先混合在一起,直接使用。其TMB双组分显色液有50*2、100*2、250*2、500*2四个规格,可根据不同实验的需求选择不同规格产品。

 

  • 另外,还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反应产物呈蓝绿色,且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面,ABTS与TMB因致癌可能性较小,因此皆是值得被优选的供氢体。

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碱性磷酸酶AP:

Western Blot检测系统中常用交联酶两大家族中的另外一类就是AP——碱性磷酸酶。由于AP实验经常会遇到膜上显色背景偏高的问题,所以就WesternBlot本身来说偏爱HRP的要比AP多。AP显色底物生成的产物主要是蓝紫色,成像性好,容易拍照。早些年前,AP检测的灵敏度比HRP高,整个显色过程更有“技术性”,有许多个人技巧在里面,让人取舍两难。如今由于HRP的化学发光底物已经不断改进而使得灵敏度不断提高,化学发光显色上HRP和AP不相上下,但是生色反应来说,AP显色的灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。

AP常用的检测底物常用的是BCIP ,NBT 和INT。为了达到更好的效果我们经常会将其结合使用

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