Western Blot常见问题及注意事项

常见问题

解决对策及注意事项

两快玻璃板之间灌胶,胶总是不平

玻璃没有洗干净，应该要洗得非常干净

过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快，也会造成胶不平现象

加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平

胶总是漏

避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损

胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶

将两块玻板摆放*对齐，底部处于同一个平面

膜上有明显气泡

操作时将气泡*排除

靠膜一侧的滤纸应铺平

特异性低

优化一抗

提高一抗和二抗的稀释度

降低SDS-PAGE中蛋白的上样量

背景高

优化封闭液

优化洗涤缓冲液，增加洗涤次数

减少曝光时间

较低的信号

优化一抗

浓缩样品

选择更高敏感度的发光底物

条带跑得比正常的窄

可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀

可能是样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢

可能是系统的ph出了问题，有可能是电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液。

条带呈“微笑”和“倒微笑”效果

"微笑"是因为灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。

“倒微笑“现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不*便会产生这种现象

凝胶肿胀或卷曲

注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。