动物基因组DNA的提取

动物基因组DNA的提取

实验简介

    DNA是遗传信息的载体，是重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等实验，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提，因此基因组DNA的提取也是分子生物学试验技术中重要、基本的操作之一。

实验原理、目的

    DNA是遗传信息的载体，是重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等实验，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提，因此基因组DNA的提取也是分子生物学试验技术中重要、基本的操作之一。 染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。 整个实验可分为细胞裂解、DNA分离与纯化和DNA的洗脱收集。

实验步骤

     1、取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

     2、加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）

     3、加等量的酚：氯仿：异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

     4、取上层溶液另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

     5、取上层溶液另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。

     6、小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

     7、用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

     8、小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

     9、加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。

     10、吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

常见问题

1、尽量简化操作步骤，缩短提取过程。

2、减少化学因素对核酸的降解。

3、减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温。

4、防止核酸的生物降解：排除核酸酶。