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荧光免疫染色和DAPI染色实验步骤

发布日期: 2016-04-22
浏览人气: 3642

免疫染色实验方法和步骤

免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等,可以参考如下步骤进行操作。 

1. 样品准备(Sample preparation) 

对于贴壁细胞: 

可以直接用多孔板,例如6孔板、24孔板等,培养细胞,然后到预定时间时进行固定等后续操作。  也可以用洁净的盖玻片,70%乙醇中浸泡后,用无菌的镊子放置到6孔板内,然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养,待细胞贴在盖玻片上生长良好后,即可进行固定等后续操作。 

对于悬浮细胞: 

把细胞先在固定液中固定,然后把细胞滴加在载玻片上,干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳,可以在载玻片上用PDL等物质进行处理,以增强载玻片的粘附能力。 

对于冷冻切片: 

切片放置在载玻片上后,可以直接进行固定等后续操作。 

对于石蜡切片: 

脱蜡:切片在二甲苯中脱蜡5分钟,再换用新鲜的二甲苯脱蜡,共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟,两次。90%乙醇5分钟,两 次,70%乙醇5分钟,一次。蒸馏水5分钟,两次。 

抗原修复:根据不同的抗原和抗体,可以选择把切片放置在如下抗原修复液中,10mM柠檬酸钠,pH6.0,或1mM EDTA,pH8.0,或10mM Tris, pH10.0,95℃加热12分钟,大约在30分钟内缓慢冷却室温。 

2. 固定
可以使用适当的固定液固定细胞或切片,例如碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)。固定完毕后,可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次,每次5分钟。 
3. 封闭(Blocking) 

加入免疫染色封闭液(P0102),封闭60分钟。如果背景较高,可以4℃封闭。 

从封闭开始所有的步骤,一定要注意样品的保湿,避免样品的干燥,否则极易产生较高的背景。 

在整个免疫染色过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02),侧向摆动速度比较缓慢,而且也容易让溶液覆盖样品。如果样 品比较容易脱落,也可以把所有的步骤放置在桌面上静止进行,即封闭、抗体孵育、洗涤等步骤均不需摇动,但静止操作时宜适当延长作用时间或次数。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 

参考一抗的说明书,按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(P0103)稀释一抗。 

用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果 一抗孵育一小时效果不佳,可以4℃缓慢摇动孵育。 

回收一抗。加入免疫染色洗涤液, 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5分钟。共洗涤3次。 

如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 

参考二抗的说明书,按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液(P0108)稀释荧光标记的二抗,或者用免疫染色(非荧光)二抗稀释液(P0110)稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二抗。辣根过氧化物酶(A0201/A0208/A0216)可向碧云天订购。 

用微型台式真空泵吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 

回收二抗。加入免疫染色洗涤液, 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5分钟。共洗涤3次。 如果结果背景较高,可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 
6. 蛋白检测(Detection of proteins) 

对于免疫荧光染色,此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。 

对于非免疫荧光染色可以选用DAB等适当的显色底物,或AB检测体系等进行后续检测。 
7. 多重染色(Multiple staining) 

如果进行的是免疫荧光染色,通常都可以进行多重染色。对于可以产生有色沉淀物的染色反应,例如DAB染色,一般不适合再进行多重染色。

多重荧光染色: 

可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193)进行红色荧光染色,随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186)进行绿色荧光染色,在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色,染色后为蓝色荧光。 

用HE染色进行复染: 
 

免疫荧光染色后可以用苏木素伊红(HE)染色试剂盒(C0105)进行HE染色。

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