胰糜蛋白酶的制备

胰糜蛋白酶的制备 
【实验目的】  ：掌握从组织中制备胰糜蛋白酶的原理和方法。 
【实验原理】  ：胰糜蛋白酶是胰腺产生的一种消化酶。初以酶原的形式被合成与分泌，之后在胰蛋白酶的作用下被水解而激活。胰糜蛋白酶是一种催化肽键的肽链内切酶，主要切断色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的羧基侧肽键。 
酶绝大多数都是蛋白质，因此一般提纯蛋白质的方法也适用于酶的提纯，所不同的是在提纯酶的过程中要不断地进行酶活力的检测，本实验主要涉及提取过程。 
【实验药品与器材】 
（一）材料和试剂 
1.主要材料：新鲜猪胰脏1个。 
2.主要试剂： 
2.5mol/LH2SO4溶液，固体（NH4）2SO4，氯化钙粉，1%酪蛋白溶液，）0.1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液，1％BaCl2溶液，5mol/LNaOH溶液。 
（二）主要器材 
组织捣碎机、手术器械、纱布、漏斗、透析袋、离心机、烧杯、pH计、离心管。 
【实验方法与步骤】 
1.提取取新鲜猪胰脏，放在盛有冰冷2.5mol/LH2SO4溶液的容器中，保存在冰箱中待用。去除胰脏表面的脂肪和结缔组织后，称重。用组织捣碎机粉碎。然后混悬于两倍体积的冰冷2.5mol/LH2SO4溶液中，置于冰箱中过夜。将上述混悬液以3000rpm离心10min，上层液经两层纱布过滤烧杯中；将沉淀再混悬于等体积的冰冷2.5mol/LH2SO4溶液中，再离心，将两次上层液合并，即为提取液。此时可留样测酶的活力。 
2.分离。 
3.结晶取分离所得的胰糜蛋白酶溶于3倍体积的水中（此时可取0.5ml留样测酶活力），加（NH4）2SO4（1.44g/10ml），用5mol/LNaOH溶液调pH6.0，在室温放置12h即可出现结晶，在显微镜下观察结晶形状。 
【注意事项】 
1.整个操作过程在0℃～5℃条件下进行。 
2.实验材料应采用新鲜胰组织。 
3.分清实验过程中每次离心后各保留的是上清液，还是沉淀。 
4.离子强度、pH、温度、试管的洁净度等均可影响酶的活性，如需进一步进行活性测定，务必保证固定的实验条件，严格按照程序操作。