细胞培养试剂 活性氧检测试剂盒

细胞培养试剂 活性氧检测试剂盒
货号 ：CA1410
规格 ：100-500T

产品内容 ：

产品简介 ：
    活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、 过氧化氢、 及其下游产物过氧化物和羟化物(O2? ? ,H2O2, ?OH, ONOO ? , ?NO)等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。采用
2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今常用、灵敏的细胞内活性氧检探针。DCFH-DA 没有荧光，进入细胞后被酯酶水解为 dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在时 DCFH 被氧化为不能透过细胞膜的强绿色荧光物质 dichlorofluorescein (DCF)，其荧光在激发波长 502 nm，发射波长 530 nm 附近有大波峰，强度与细胞内活性氧水平成正比。此活性氧检测系统本底低，灵敏度高，重复性好，操作简便。
本试剂盒适于荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等图像检测，荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪定量 ROS 检测。

作波长：
适宜激发波长 500、485 (500 ± 15 nm)，适宜发射波长 525 (530 ± 20 nm)。也可按照 FITC 荧光检测条件检测。

操作步骤 ：
一 、 试剂准备 ：
    1. DCFH-DA 可稀释于培养基或缓冲液中。 血清或培养基颜色并不影响 DCFH-DA 及细胞内荧光产生， 但可能会影响荧光显微镜观察，干扰荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪荧光测定。可将 DCFH-DA 稀释于无酚红培养基或适宜的缓冲液如 PBS 中。这依赖于使用何种荧光设备进行测定。
    2. 加入 DCFH-DA 的时机或孵育时间，以终能顺利检测细胞内活性氧为目的。药物处理时间较短(<2小时)或预计 ROS 效应较弱，可先加或同时加入 DCFH-DA。反之，treat 刺激时间较长(>6 小时)或预计产生ROS 效应较强，可后加 DCFH-DA。
    3. 活性氧供体含高纯度 12 mM H2O2。加入细胞后其本身即是一种活性氧，而且在代谢过程中可产生其它类型的活性氧，均可使 DCFH-DA 氧化为 DCF 呈现强绿色荧光。因而，用户可使用该试剂作为测试实验系统或仪器的阳性试剂，以初步观察细胞活性氧所产生的荧光的一般特征，并且也可以将该实际作为实验的一个阳性对照。推荐该试剂的细胞工作浓度为 20~100 µM 或更低浓度，但超过 200µM 将产生细胞毒。如果用户熟悉 ROS 荧光或实验没有必要采用阳性对照，可以不加该试剂。
二 、 加入荧光探针 ：
    1. 加入 DCFH-DA 于培养基，推荐初始工作浓度为 10 µM。对不同的细胞和处理，DCFH-DA 工作浓度可为 100 nM~20 µM，需进行预实验确定合适的浓度。总体稀释倍数应在 1:500~1000 以上以避免 DMSO 对细胞的影响。以 DMSO 作为溶剂对照。
    2. 37 ºC 孵育细胞 30min~几个小时，通常 30-60min 即可。孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。
    3. PBS 洗涤细胞 2 次。
三 、 荧光检测
    采用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜图像检测照相，绿色荧光强度代表活性氧水平。也可进行微板荧光分析仪(multiwell fluorescence plate reader)实时或每 10 分钟分时逐点检测荧光强弱。对于流式细胞仪可将细胞用胰酶消化 PBS 洗涤后重悬检测。

相关文献：

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