人骨髓中性粒细胞分离液试剂盒

人骨髓中性粒细胞分离液试剂盒
货号:P2600
规格：200ml/kit
保存 ：室温避光储存，有效期少 2 年。

试剂盒内容 ：

全血及组织稀释液     100ml
细胞洗涤液           100ml
试剂A                100ml
试剂F                100ml
红细胞裂解液         100ml
说明书               1 份

各种动物骨髓细胞的采集方法
    1. 大鼠、小鼠骨髓的采集：用颈椎脱臼法处死动物,剥离出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的F液，冲洗出胸骨或股骨中全部骨髓液，以500g（约1800 转/分）离心20 分钟，弃上清。沉淀以F液重复洗涤一次后用全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×10 8 -1×10 9 个/ml），备用。
   2. 大动物骨髓的采集：
    A．骨髓穿刺点定位
  （1）胸骨：穿刺部位在胸骨中线,胸骨体与胸骨柄连接处,或选胸骨上1/3 部。
  （2）胫骨：穿刺部位在胫骨内侧,胫骨上端的下方1 厘米处。
  （3）肋骨：穿刺部位在第5～7 肋骨各自的中点上。
  （4）髁骨：穿刺部位在髁前上棘后2～3 厘米的髁嵴。
  （5）股骨：穿刺部位在股骨内侧面,靠下端的凹面处。
B．骨髓穿刺方法
  （1）实验动物按要求固定，穿刺部位去毛、消毒、麻醉，要求局部麻醉范围直达骨膜，也可作全麻。
  （2）操作人员带消毒手套，确定穿刺点，估计从皮肤到骨髓的距离并依此固定骨髓穿刺针长度。左手拇、食指绷紧穿刺点周围皮肤，右手持穿刺针在穿刺点垂直进针，小弧度左右旋转钻入，当有落空感时表示针尖已进入骨髓腔。用左手固定穿刺针，右手抽出针芯，连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时立即停止抽吸，收集骨髓细胞加入4-5ml F 液混匀，以500g（约1800 转/分）离心20 分钟，弃上清，沉淀以F 液重复洗涤两次后用全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×10 8 -1×10 9  个/ml），备用。
 （3）左手压住穿刺点周围皮肤，迅速拔出穿刺针，用棉球压迫数分钟。如穿刺的是肋骨，除压迫止血外，还需胶布封贴穿刺点，防止发生气胸。
3. 人骨髓的采集：
    临床方法收集骨髓细胞加入4-5ml F液混匀，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃上清，沉淀以F液重复洗涤两次后用含20%胎牛血清的全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×10 8 -1×10 9 个/ml），备用。

人或各种动物骨髓中性粒细胞分离液试剂盒
    1．取 1ml 骨髓细胞悬液（制备方法详见“一、骨髓细胞的采集方法”）小心叠加在A 液之液面上（比例为1：1），20℃±2℃，500g（约1800 转/分），离心25 分钟（半径15cm 水平转子）。
     此时离心管中由上下细胞分四层。*层;为稀释液层。第二层；为环状乳白色的单个核细胞层。第三层；为略带浑浊的分离液层（富集一定量的中性粒细胞）。第四层；为红细胞层。弃去*层血浆层及第二层细胞，收集第三层细胞和第四层红细胞层，放入含细胞洗涤液10毫升的试管中，充分混匀后，以500g（约1800 转/分）离心30分钟。沉淀经1次洗涤后用红细胞裂解液裂解红细胞，再经3次洗涤去除红细胞内容物和碎片后取沉淀细胞即为所需中性粒细胞。
注： 提取率约为80%。
    2. 红细胞裂解过程详见“三、红细胞裂解液使用说明”。
分离图例：
三 、 红细胞裂解液使用说明
    红细胞裂解液配方经过本公司优化，在裂解红细胞的同时不损伤并在一定程度上保护淋巴细胞(lymphocyte)或其它有细胞核的细胞，所获得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。另外，本裂解液中无 DNA 及 RNA 酶，配合细胞分离液使用所提细胞可广泛用于细胞培养及分子生物学实验。
    红细胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也称 ACK Lysis Buffer，是一种用于从人或鼠等的血液或组织细胞样品中裂解并去除无细胞核红细胞的溶液。本裂解液不适用于有细胞核红细胞的裂解，例如鸟或禽类的红细胞。本裂解液经过无菌处理，处理过的血液或组织细胞样品可以用于后续的原代培养、细胞融合以及核酸或蛋白的提取及各种常规的分析和检测。
 

使用说明：
    A.  对于组织细胞样品 ：
     a. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。
     b. 加入 3-5 倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解 1-2 分钟。例如细胞沉淀的体积为 1ml，则加入 3-5ml 的红细胞裂解液。本步骤在室温或 4 度操作均可。
     c. 400-500g 离心 5 分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。
     d. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤 b 和步骤 c 一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。
     e. 洗涤 1-2 次：加入适量 PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g 离心 2-3 分钟，弃上清。可再重复 1 次，共洗涤 1-2 次。洗涤液的用量通常应少为细胞沉淀体积的 5 倍。4℃离心效果更佳。
     f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

B.  对于组织细胞样品无需洗涤的快速操作步骤 ：
    a. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。
    b. 对于 0.2ml 细胞沉淀加入 1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解 1-2 分钟。本步骤在室温或 4 度操作均可。
    c. 加入 15-20ml PBS、HBS S、生理盐水或无血清培养液，混匀。
    d. 400-500g 离心 5 分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。
    e. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤 2 和步骤 3 一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。
    f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。
注：对于常规步骤，多一步洗涤过程中的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同时不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。
   C. 对于血液样品 ：
    a. 取新鲜抗凝血，400-500g 离心 5 分钟，离心弃上清。
    b. 加入 6-10 倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解 1-2 分钟。例如细胞沉淀的体积为 1ml，则加入 6-10ml 的红细胞裂解液。本步骤在室温或 4 度操作均可。注意：对于鼠的血液，裂解 1-2 分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间 4-5 分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。
    c. 400-500g 离心 5 分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。
    d. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤 2 和步骤 3 一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。
    e. 洗涤 1-2 次：加入适量 PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g 离心 2-3 分钟，弃上清。可再重复 1 次，共洗涤 1-2 次。洗涤液的用量通常应少为细胞沉淀体积的 5 倍。4℃离心效果更佳。
    f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。
注：对于微量或少量的血液样品，可以在*步中不进行离心弃上清的操作，直接在第二步中加入 10 倍血液体积的红细胞裂解液，并在室温或 4 ℃裂解 4 -5 分钟。对于鼠的血液，裂解 4-5 分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间 10 分钟，但通常不宜超过 15 分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。后续步骤相同。
 

D.  对于血液样品无需洗涤的快速操作步骤 ：
    a. 每 1ml 新鲜抗凝血中加入 10 ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解 4-5 分钟。本步骤在室温或 4 度操作均可。注意：对于鼠的血液，裂解 4-5 分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间 10 分钟，但通常不宜超过 15 分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。
    b. 加入 20-30ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，混匀。
    c. 400-500g 离心 5 分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。
    d. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤 2 和步骤 3 一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。
    e. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。
注：对于常规步骤，多一步洗涤过程的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同时不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。

四 、  注意事项
    A． 本分离液是敏光型的，在运输和贮藏过程中应在18℃-25℃避光保存，启封后置4℃保存避免微生物污染。另外，本品为真空包装，未启封前置于10℃ 以下易出现白色结晶，影响分离效果。
    B． 待分离的样本要求新鲜，避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在20℃水浴箱中复温20 分钟保证分离液和所分离样本温度在20℃±2℃时分离效果好，且所有操作过程一定要在无菌条件下进行。
    C． 由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以调节离心转数，调节离心的时间，摸索的分离条件（具体分离条件各实验室自定）。
    D． 好使用无静电反应的离心管，推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。

五 、 产品性能指标

pH 7.0-7.5
渗透压 280-340mOsmol/kg
内毒素 ≤0.5EU/ml
无菌 直接接种培养14 天后培养基澄清
澄明度及不溶性颗粒物 每50ml 溶液中含10µm 以上的不溶性微粒20 粒以下，
含25µm 以上的不溶性微粒5 粒以下

六 、 贮藏及保存期限

     18℃-25℃避光保存，有效期两年。启封后置4℃保存，有效期一周。
     注：若保证无微生物污染，启封后可置4℃长期保存。但应注意保存温度较低时本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

人骨髓中性粒细胞分离液试剂盒订购说明：

1、绝大部分产品备有现货，一般情况下都能订货当日发货。 
2、部分非常用产品，需提前1－2日预订，海外期货则需要提前3-6周预订。 
3、部分产品价格会因货期、批次等因素发生变化，若有变动以订货当日新价格为准。 
4、每日订单截止时间为16点整，部分城市可到17点整，因超过截止时间造成当日不能发货的将于次日安排发货。
5、请办理完货款后，将收据、底单等连同收货人的地址、姓名、等以传真、、短信、等形式通知我们。

运输说明：

1、极低温产品：极低温产品运输过程中加装干冰运输。用干冰把产品包裹起来，再用泡沫盒密封，胶带层层粘住泡沫盒，放入索莱宝的箱子，然后交付给合作快递，安全快速高效放心的送客户的手中，保证产品的性质稳定如一，为您的实验保驾护航。
2、低温产品：低温产品运输过程中加装索莱宝冰袋运输。事先用冰袋把产品包裹起来，再使用泡沫盒密封，用胶带严实密封泡沫盒，再放入索莱宝的箱子（保温效果少可以持续一周），然后交付给合作快递，安全快速高效放心的送客户的手中，保证产品的性质稳定如一，为您的实验保驾护航。
3、常温产品：常温产品运输过程中无需加冰或者特殊包装。产品由公司库房人员快速配货，准确快速高效的快递保证产品快速送达您的手中。