人外周血中性粒细胞分离液试剂盒

人外周血中性粒细胞分离液试剂盒   
货号：P9040
规格：2×200ml/KIT
保存：室温避光储存，有效期少 2 年。

产品组成：
                   名称              规格
                   试剂 A            200ml
                   红细胞裂解液      100ml
                   全血及组织稀释液  200ml
                   细胞洗涤液        200ml
 

注意事项：
     A．本实验要求，在正常大气压下，分离液、分离样本以及分离环境温度为20℃±2℃。分离液在低温时呈较高密度，在高温时呈较低密度。细胞分离液从冰箱取出后，不可立即使用，操作前可将样本和分离液复温18-22℃。为获得的实验结果，好在取血后2小时内进行实验，血液提取后存放时间越长细胞活性越低。
    B．实验过程中，如需稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca 2+ 、Mg 2+ 离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降低细胞得率及纯度。
    C．优抗凝剂选择：EDTA、枸橼酸、肝素。注意在血液稀释过程中去除抗凝剂体积。
    D．好使用无静电反应的离心管，推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。
    E．由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以调节离心转数和离心时间，摸索的分离条件（具体分离条件各实验室自定）。
 

分离方法 ：
    1. 取1ml新鲜抗凝血，与全血及组织稀释液1:1 混匀后小心加于1份A液之液面上；
    2. 以500g（约1800转/分）离心25分钟(半径15cm水平转子)。
    3. 此时离心管中由上下细胞分四层。*层：为血浆层。第二层：为环状乳白色的单个核细胞层。
    第三层：为略带混浊的分离液层（富集一定量的中性粒细胞）。第四层：为红细胞层。弃去*层血浆层及第二层细胞，收集第三层分离液层和第四层红细胞层，放入含细胞洗涤液10ml的试管中，充分混匀后，以500g约（1800转/分）离心30分钟。沉淀经1次洗涤后用红细胞裂解液裂解红细胞，再经3次洗涤去除红细胞内溶物和碎片后取沉淀细胞即为所需中性粒细胞。
    注：A. 提取率约为80%。
    B. 红细胞裂解过程详见“红细胞裂解液使用说明”。

红细胞裂解液使用说明 ：
    本公司红细胞裂解液在裂解红细胞的同时不损伤并在一定程度上保护淋巴细胞(lymphocyte)或其它有细胞核的细胞，所获得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。另外，本裂解液中无DNA及RNA酶，配合细胞分离液使用所提细胞可广泛用于细胞培养及分子生物学实验。
    红细胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也称ACK Lysis Buffer，是一种用于从人或鼠等的血液或组织细胞样品中裂解并去除无细胞核红细胞的溶液。
    本裂解液不适用于有细胞核红细胞的裂解，例如鸟或禽类的红细胞。本裂解液经过无菌处理，处理过的血液或组织细胞样品可以用于后续的原代培养、细胞融合以及核酸或蛋白的提取及各种常规的分析和检测。

使用说明：
    A.  对于组织细胞样品：
    a. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。
    b. 加入3-5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入3-5ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。
    c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。
    d. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。
    e. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应少为细胞沉淀体积的5倍。4℃离心效果更佳。
    f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。
    B.  对于组织细胞样品无需洗涤的快速操作步骤：
    a. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。
    b. 对于0.2ml细胞沉淀加入1ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。本步骤在室温或4度操作均可。
    c. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，混匀。
    d. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。
    e. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。
    f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。
注：对于常规步骤，多一步洗涤过程中的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同时不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。
    C.  对于血液样品：
    a. 取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。
    b. 加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入6-10ml的红细胞裂解液。 本步骤在室温或4度操作均可。 注意： 对于鼠的血液， 裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。
   c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。
   d. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。
   e. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应少为细胞沉淀体积的5倍。4℃离心效果更佳。
   f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。
注：对于微量或少量的血液样品，可以在*步中不进行离心弃上清的操作，直接在第二步中加入10倍血液体积的红细胞裂解液，并在室温或4℃裂解4-5分钟。对于鼠的血液，裂解4-5分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间10分钟，但通常不宜超过15分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。后续步骤相同。
   D.  对于血液样品无需洗涤的快速操作步骤：
   a. 每1ml新鲜抗凝血中加入10ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解4-5分钟。本步骤在室温或4度操作均可。注意：对于鼠的血液，裂解4-5分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间10分钟，但通常不宜超过15分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。
   b. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，混匀。
   c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。
   d. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。
   e. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。
      注：对于常规步骤，多一步洗涤过程的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同时不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。

产品性能指标 ：

pH 7.0-7.5
渗透压 280-340mOsmol/kg
内毒素 ≤0.5EU/ml
无菌 直接接种培养14 天后培养基澄清
澄明度及不溶性颗粒物 每50ml 溶液中含10µm 以上的不溶性微粒20 粒以下，
含25µm 以上的不溶性微粒5 粒以下

贮藏及保存期限 ：
    本分离液是敏光型的，应在18℃-25℃避光保存，有效期两年。启封后置4℃保存，有效期一周，若保证无微生物污染，启封后可置4℃长期保存。未启封前保存温度较低（10℃以下）时分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

人外周血中性粒细胞分离液试剂盒 

参考文献：
《miR-20a inhibits the killing effect of natural killer cells to cervical cancer cells by downregulating RUNX1》 作者:Suo-Yu Zhu,Qun-Ying Wu,Chen-Xia Zhang,Qiong Wang,Jing Ling,Xian-Ting Huang,Xia Sun,Ming Yuan,Dan Wu,Hua-Fang Yin 期刊:Biochemical and Biophysical Research Communications 影响因子:2.559 PMID:30249397