线粒体复合体 Ⅳ 试剂盒

线粒体复合体 Ⅳ 试剂盒说明书
产品简介 ：
线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素 C 氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催
化还原型细胞色素 C 的氧化，并终把电子传递给氧，生成水。
还原型细胞色素 C 在 550nm 有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素 C 生成氧化型细胞色
素 C，因此 550nm 光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。
试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
产品内容 ：
试剂一：25 mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：5 mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：0.5 mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂四：液体 10 mL×2 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×2 支，-20℃保存；
试剂六：粉剂×2 支，-20℃保存；
工作液的配制：临用前取试剂四、试剂五、试剂六各一支，将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合
溶解。分批配制工作液是为了防止当天不能测完，导致工作液失败。
操作步骤 ：
一 、 线粒体 复合体 Ⅳ 的提取 ：
(1) 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
(2) 将匀浆 4℃ 600g 离心 5min。
(3) 将上清液转移另一离心管中，4℃ 11000g 离心 10min。
(4) 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄露的复合体Ⅳ（此步可选做）。
(5) 在沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超生波破碎（功率 20%，超声 3 秒，间歇 10 秒，重复 30
次），用于复合体Ⅳ酶活性测定，并且用于蛋白含量的测定。
二 、 测定 步骤 ：
1. 调零
用蒸馏水于 550nm 处调零
2. 样本测定
(1) 取 800uL 工作液加入 1mL 玻璃比色皿中，在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）孵育 5min。
(2) 取出比色皿，加入 40uL 样本，混匀，立即记录 550nm 处初始吸光值 A1，37℃（哺乳动物）或 25℃（其
他物种）中准确反应 1min，记录 550nm 处 1min 后的吸光值 A2，计算 ?A=A1-A2。
注意：
若 A1-A2 大于 0.2，需将样本用试剂二稀释适当倍数，使 A1-A2 小于 0.2，可提高检测灵敏度。
Solarbio
Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd
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复合体 Ⅳ 活?单位的计算 ：
1 、 组织中 复合体 Ⅳ 活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力（U/mg prot）=反应总体积（840µL）÷样本体积（40µL）÷反应时间(1min)÷细胞色素 C 消光
系数（19.1×10 -3 ）×?A÷蛋白浓度（mg/mL）=1099×?A ÷蛋白浓度（mg/mL）
(2)按样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力（U/g 鲜重）=反应总体积（840µL）÷样本体积（40µL）÷反应时间(1min)÷细胞色素 C 消光系
数（19.1×10 -3 ）×?A÷样本鲜重（g/mL）=1099×?A ÷样本鲜重（g/mL）
2 、 细菌或细胞中 复合体 Ⅳ 活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力（U/mg prot）=反应总体积（840µL）÷样本体积（40µL）÷反应时间(1min)÷细胞色素 C 消光
系数（19.1×10 -3 ）×?A÷蛋白浓度（mg/mL）=1099×?A÷蛋白浓度（mg/mL）
(2)按细菌或细胞密度计算
单位定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力
单位。
复合体Ⅳ活力（U/10 4 cell）=反应总体积（840µL）÷样本体积（40µL）÷反应时间(1min)÷细胞色素 C 消光系
数（19.1×10 -3 ）×?A÷细菌或细胞密度（10 4 /mL）=1099×?A÷细菌或细胞密度（10 4 /mL）