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产品名称:

三磷酸循环系列试剂盒 一管式点突变试剂盒

产品品牌: SOLARBIO/索莱宝 价格:
厂商性质: 生产厂家 产品时间: 2024-03-24
三磷酸循环系列试剂盒 一管式点突变试剂盒
传统的方法需要使用单链 DNA 模板,而得到单链 DNA 模板又需要先将基因克隆到类似 M13 这种载体中,操作过程冗长。为了克服这些缺点,本公司将突变位点设计到一对互补的引物中,用高保真扩增质粒模板,然后用 Dpn I 去除原始的甲基化模板,新合成的DNA 通过互补形成带切口的双链质粒,直接用于转化感受态细菌。

产品概述

品牌SOLARBIO/索莱宝

三磷酸循环系列试剂盒 一管式点突变试剂盒
One-Stop Point mutation Kit


产品及特点
    基因的定点突变是重要的分子生物学技术,广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研
究等领域。但传统的方法需要使用单链 DNA 模板,而得到单链 DNA 模板又需要先将基因克
隆到类似 M13 这种载体中,操作过程冗长。为了克服这些缺点,本公司将突变位点设计到一
对互补的引物中,用高保真扩增质粒模板,然后用 Dpn I 去除原始的甲基化模板,新合成的
DNA 通过互补形成带切口的双链质粒,直接用于转化感受态细菌。本方法过程示意图如下:


 

本产品具有下列特点:
    1. 直接使用质粒 DNA 作为模板,免去了制备单链 DNA 的步骤。
    2. 基于高保真 PCR,对模板 DNA 序列没特殊要求,可以用于突变任何序列。同时对模板的需求量很少。
    3. 一管式,全部在一个优化的缓冲体系中完成,非常简单。
    4. 使用 Dpn I 去除未突变模板,突变效率高达 90%。
    5. 可用于制备点突变,缺失突变和插入突变。
    6. 本产品 A 型适用于 8 kb 一下,B 型适用于 8-15 kb。


规格及成分


成 份                 A 型10次包装      B型10次包装
高保真酶A型                  10 uL           无
高保真酶B型                  无                10 uL
5×高保真酶 Buffer A 型     100 uL                 无
5×高保真酶 Buffer B 型     无                     100 uL
dNTP(2.5 mM each)         50 uL                  50 uL
Dpn I 酶                      10 uL                  10 uL
超纯水                        1 mL                   1 mL
使用手册                      1 份                   1 份
运输及保存 低温运输、-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂   质粒 DNA、突变引物、细菌转化试剂


使用方法
一、 引物设计及注意事项
    用于特定基因突变的引物必须用户单独设计,请参考如下一些基本原则进行设计。
    1. 共需设计两条*互补的一对引物, 它们覆盖要扩增的突变区位点, 突变位点好放在引物的中心。可以先集中设计一条,然后就可得互补的另一条引物。
    2. 引物的长度通常为 25-45 个碱基。引物中突变位点任何一侧都必需满足 Tm 大于45 的条件,Tm 计算方式为 Tm=4×(GC 碱基数)+2×(AT 碱基数)。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就达到此标准,它的突变位点 AAG 所放位置使左侧 Tm=46;右侧 Tm=48,均大于 45。
    3. 尽量把引物的 GC 含量控制在 40%-60%,结尾的 1-3 个碱基好是 G 或 C。
    4. 尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。
    5. 好使用经过 PAGE 纯化的引物或更高纯度的引物。


二、待突变模板质粒的选择
    1. 必需使用从 dam+的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变,否则 Dpn I 不能把没有酶切的质粒 DNA 切除,产生大量的假阳性。必需使用从 dam+的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变,否则 Dpn I 不能把没有酶切的质粒 DNA 切除,产生大量的假阳性。
    常用的大部分大肠杆菌都是 dam+的,包括 DH5α、JM109 等。不能使用 JM110和 SCS110 以及其它 dcm-菌种。
    2. 待突变质粒和目的基因的 GC 含量应该在 40-55%,没有任何 GC 含量超过 70%、长度在 50bp 以上的区域。如果质粒 GC 含量过高,请先把目的基因克隆到其它合适的载体上,再进行基因定点突变反应。如果目的基因 GC 含量过高,而突变位点不在高 GC 含量区域,可以先把该基因的不含高 GC 含量的一个区域克隆出来,进行定点突变,然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果突变位点在高 GC 区,则可以使用高 GC PCR 反应试剂。


三、 基因定点突变反应
1. 在一个塑料离心管中加入下列成分:

待突变模板质粒          0.1-0.5 ug
5×高保真酶 Buffer      5 uL
引物一 (10-20 uM)       1 uL
引物二 (10-20 uM)       1 uL
dNTP Mix (2.5 mM each)  4 uL
补水到                  49 uL

2. 加入 1 uL 高保真 DNA 聚合酶,混匀,如果 PCR 仪没有热盖则需要加少量石蜡油。
放入 PCR 仪器中按下面参数进行 PCR:

步骤 温度时间 循环数
变性95℃ 1 分钟 1 次
PCR(注:只 18 次循环)95℃40 秒18 次
PCR(注:只 18 次循环)60℃1 分钟18 次
PCR(注:只 18 次循环)68℃ 1 分钟/Kb18 次
延伸72℃ 10 分钟1 次
保存4℃ 长时间保持 

 

四、Dpn I 消化:
    PCR 反应后,直接在 PCR 反应体系中加入 1uL Dpn I 内切酶 (该酶在甘油保存液中会下沉到管底,故用前需要充分混匀) 。DpnI 可以酶切双链都被甲基化的模板质粒,也能降解一条链被甲基化的双链质粒。混匀后 37℃孵育 2 小时后样品可以直接用于转化,或者-20℃保存备用。


五. 转化、挑克隆鉴定:
    每 100 微升感受态细菌 (转化效率必须在 10 7 /ug以上) 中可以加入 5-10 微升经过DpnI消化后的突变产物,按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作。如果PCR使用了石蜡油,在转化时千万别把它带入转化反应,否则会严重影响转化效率。在涂板前通过离心浓缩的办法,把所有被转化后的细菌全部涂布到含有适当抗生素的平板上培养。通常会得到 50 个以下的克隆,可按常规方法制备质粒并测序。


六、常见问题:
     1. 转化后没有克隆或克隆数极少:(1) 感受态细菌效率不够高,请检测一下感受态细胞的效率,确保转化效率在 10 7 /ug。(2) 把Dpn I消化后的产物用常规的乙醇沉淀浓缩,这样就可以把所有的产物全部用于转化。(3) 优化基因定点突变中的PCR参数。可以把初的 95℃变性时间延长为 2 分钟,循环中 95℃变性的时间延长 1 分钟,把循环中的 68℃的延伸时间改为 1.5 分钟/kb 2 分钟/kb,退火可以改为 60-55℃或 65-55℃等的touch down,退火时间也可以适当延长。(4) 引物设计有问题。通过突变反应中的PCR没有很好地扩增出预期的突变质粒。
     2. 有克隆, 但没有或很难检测到预期的突变克隆: (1) 使用的待突变的模板质粒量过多,导致 Dpn I 消化时不*,可减少质粒用量。
     3. 有突变克隆,但突变位点不是预期的位点:(1) 引物设计不佳,退火温度过低,导致引物退火到错误的地方。(2) 引物质量较差,没有经过 PAGE 纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物,容易导致非预期的突变。

 

三磷酸循环系列试剂盒 一管式点突变试剂盒订购说明:

1、绝大部分产品备有现货,一般情况下都能订货当日发货。 
2、部分非常用产品,需提前1-2日预订,海外期货则需要提前3-6周预订。 
3、部分产品价格会因货期、批次等因素发生变化,若有变动以订货当日新价格为准。 
4、每日订单截止时间为16点整,部分城市可到17点整,因超过截止时间造成当日不能发货的将于次日安排发货。
5、请办理完货款后,将收据、底单等连同收货人的地址、姓名、等以传真、、短信、等形式通知我们。


运输说明:

1、极低温产品:极低温产品运输过程中加装干冰运输。用干冰把产品包裹起来,再用泡沫盒密封,胶带层层粘住泡沫盒,放入索莱宝的箱子,然后交付给合作快递,安全快速高效放心的送客户的手中,保证产品的性质稳定如一,为您的实验保驾护航。
2、低温产品:低温产品运输过程中加装索莱宝冰袋运输。事先用冰袋把产品包裹起来,再使用泡沫盒密封,用胶带严实密封泡沫盒,再放入索莱宝的箱子(保温效果少可以持续一周),然后交付给合作快递,安全快速高效放心的送客户的手中,保证产品的性质稳定如一,为您的实验保驾护航。
3、常温产品:常温产品运输过程中无需加冰或者特殊包装。产品由公司库房人员快速配货,准确快速高效的快递保证产品快速送达您的手中。

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