品牌 | SOLARBIO/索莱宝 | CAS | 详询 |
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分子式 | 详询 | 纯度 | 详询 |
分子量 | 详询 | 货号 | BC0440 |
规格 | 25T/24S 50T/48S | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶测试 | 应用领域 | 环保,化工,生物产业,农业,综合 |
二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
货号:BC0440
规格:25T/24S、50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称/规格 | 25T | 50T | 保存条件 |
提取液 | 液体25 mL×1瓶 | 液体50 mL×1瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体25 mL×1瓶 | 液体50 mL×1瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2支 | 粉剂×2支 | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1支 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
25T溶液的配制:
试剂三:临用前取1支加入0.5mL蒸馏水充分溶解待用,振荡溶解后若出现浑浊可以离心使用;
试剂四:临用前加入1mL 蒸馏水充分溶解待用;
工作液的配制:临用前在试剂二中加入全部试剂一,充分混匀,在25℃孵育5min。
50T溶液的配制:
1、试剂三:临用前取1支加入1 mL蒸馏水充分溶解待用,振荡溶解后若出现浑浊可以离心使用;
2、试剂四:临用前加入2 mL 蒸馏水充分溶解待用;
3、工作液的配制:临用前在试剂二中加入全部试剂一,充分混匀,在25℃孵育5min。
产品说明:
1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco, EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一个关键酶,既控制着CO2的固定,同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流,其活性的大小直接影响着光合速率。在Rubisco的催化下,1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)与1分子的CO2结合,产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA);PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用,产生甘油醛-3-磷酸,伴随着NADH氧化生成NAD+;在340nm NADH有特征吸收峰,而NAD+没有此吸收峰,因此测定340nm吸光度下降速率可以代表Rubisco的羧化酶活性。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或细胞样本的制备:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次);10000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、称取约0.1g组织加入1mL提取液,冰浴中匀浆。10000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。建议选取新鲜的植物样本。
二、测定步骤
紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
按下表步骤加样:
试剂名称 | 测定管 | 空白管 |
样本(μL) | 100 | - |
蒸馏水(μL) | - | 100 |
试剂三(μL) | 35 | 35 |
试剂四(μL) | 35 | 35 |
工作液(μL) | 900 | 900 |
记录340nm处20s时吸光值A1和5min20s时的吸光值A2,计算ΔA测定=A1测定-A2测定。ΔA空白=A1空白-A2空白;ΔA =ΔA测定-ΔA空白。反应温度保持在25℃。(空白管只做1-2管)
三、Rubisco活性计算
按样本蛋白浓度计算
单位的定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1 nmol NADH为一个酶活力单位。
Rubisco活力(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T =344×ΔA÷Cpr
按样本质量计算
单位的定义:25℃中每 g组织每分钟氧化1 nmol NADH为一个酶活力单位。
Rubisco活力(U/g 质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T=344×ΔA÷W
按细菌或细胞数量计算
单位的定义:25℃中每1万个细菌或细胞每分钟氧化1 nmol NADH为一个酶活力单位。
Rubisco活力(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T=0.69×ΔA
V反总:反应体系总体积,1.07×10-3L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
实验实例:
取0.1g植物叶片,加入1mL提取液进行匀浆研磨,取上清之后按照测定步骤操作,测得计算ΔA测定管= A1测定-A2测定=1.279-1.206=0.073,ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.834-0.823=0.011,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.073-0.011=0.062,按样本质量计算酶活得:Rubisco活力(U/g 质量)=344×ΔA÷W=344×0.062÷0.1=213.28 U/g 质量
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