品牌 | SOLARBIO/索莱宝 | CAS | 详询 |
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分子式 | 详询 | 纯度 | 详询 |
分子量 | 详询 | 货号 | BC1610 |
规格 | 50T/48S | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 木质素过氧化物酶活性检测 | 应用领域 | 环保,化工,生物产业,农业,综合 |
木质素过氧化物酶(Lip)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
货号:BC1610
规格:50T/48S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体85mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体11mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体6mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
产品说明:
木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)(Lip)是一种含亚铁血红素的过氧化物酶,是木质素的生物降解过程中的主要木质素降解酶类。Lip在饲料资源开发以及废水、废物处理领域有着广阔的应用前景。藜芦醇可以被Lip催化发生氧化反应,其产物藜芦醛在310nm处有最大吸收峰,以藜芦醇为反应底物,通过测定310nm处藜芦醛的吸光值,可以判定Lip的酶活性。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声波细胞破碎仪、研钵/匀浆器、1mL石英比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照样本质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)加入试剂一,冰浴匀浆;10000g 4℃离心10min,取上清置冰上待测。
2、细菌或细胞样本:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议500万细菌或细胞加入 1mL 试剂一)加入试剂一,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率300W,超声 3s,间隔 7s,总时间3min),10000g 4℃离心10min,取上清置冰上待测。
3、培养液或其他液体:直接检测。若溶液浑浊则离心后取上清进行测定。
二、测定步骤
1、可见分光光度计预热30min以上,调节波长至310nm,蒸馏水调零。
2、测定前根据实验用量取出部分试剂一、试剂二、试剂三置于37℃预热10min以上。若一次性测定样本过多,可根据使用量将试剂一、二、三按6:2:1比例配成工作液后进行预热,测定时按照100μL样本+900μL工作液加入1mL石英比色皿进行测定。
3、加样表(在 1mL石英比色皿中依次加入下列试剂):
试剂名称(μL) | 测定管 |
试剂一(μL) | 600 |
试剂二(μL) | 200 |
样本(μL) | 100 |
试剂三(μL) | 100 |
将上述试剂分别加入1mL石英比色皿后迅速吹打混匀,从加完最后一个试剂开始计时,记录第15s的吸光值A1,将混合液置于37℃水浴锅/恒温培养箱培养5min,取出测定5min15s时的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1,注意保证测定时间的准确性。
三、Lip活力的计算
1.按样本蛋白质浓度计算
酶活定义:37℃,pH4.5条件下,每mg组织蛋白每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。
Lip活性(U/mg prot)= ΔA×V反总÷(ɛ×d)×109÷(V样×Cpr)÷T=215.05×ΔA÷Cpr
2.按样本质量计算
酶活定义:37℃,pH4.5条件下,每g组织每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。
Lip活性(U/g 质量)= ΔA×V反总÷(ɛ×d)×109÷(V样÷V样总×W)÷T=215.05×ΔA÷W
3.按细菌/细胞数量计算
酶活定义:37℃,pH4.5条件下,每104细菌/细胞每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。
Lip活性(U/104 cell)= ΔA×V反总÷(ɛ×d)×109÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T=215.05×ΔA÷细胞数量
4、 按照样本体积计算
酶活定义:37℃,pH4.5条件下,每mL血清或液体样本每分钟氧化1nmol藜芦醇所需酶量为一个酶活单位。
Lip活性(U/mL)=ΔA×V反总÷(ɛ×d)×109÷V样÷T=215.05×ΔA
ε:藜芦醛摩尔消光系数:9300L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应总体积,0.001L;V样:加入样本体积,0.1mL,V样总:提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5 min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
实验实例:
取0.09g杏鲍菇加入1mL试剂一进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min,取上清置冰上,之后按照测定步骤操作,测得计算A1=0.228,A2=0.55,ΔA=A2-A1=0.322,按样本质量计算酶活得:
Lip活性(U/g 质量)=ΔA×V反总÷(ɛ×d)×109÷V样÷T=672.95U/g 质量。
参考文献:
[1] Konadu K T, Harrison S, Osseo-Asare K. et al. Transformation of the carbonaceous matter in double refractory gold ore by crude lignin peroxidase released from the white-rot fungus[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2019, 143(1996):104735.
[2] Ahmed A A Q, Mckay T J M. Potential of Bacillus sp. LG7 as a Promising Source of Ligninolytic Enzymes for Industrial and Biotechnological Applications[J]. Proceedings of the National Academy of ences India, 2017.
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