总果胶含量检测试剂盒

肌酸激酶（CK）活性检测试剂盒说明书 

微量法

货号：BC1145

规格：100T/96S 

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前加5 mL蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

2、 试剂二：临用前加入0.5 mL蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

3、 试剂三：临用前加入0.5 mL蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

4、 试剂四： 临用前加入0.65 mL蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

5、 工作液：临用前根据用量将试剂一、试剂二、试剂三、试剂四、试剂五以70:4:7:10:90的比例混合（体积比）。现用现配。使用前室温孵育20min（该步骤不可省略）。

产品说明： 

肌酸激酶（Creatine Kinase，CK） (EC 2.7.3.2)也成为肌酸磷酸激酶，主要存在于心脏、肌肉以及脑等组织中，能可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，是一个与细胞能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。

 CK催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP，己糖激酶催化ATP与葡萄糖形成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖与NADP⁺生成NADPH，导致340nm光吸收值增加，以此来表示CK酶活。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、恒温水浴锅、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。

2. 血清样本：直接测定。

3. 细胞样本：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液）加入提取液，冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g离心10min，取上清待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，用蒸馏水调零。

2、 操作表：在微量石英比色皿/96孔板中加入下列试剂

三、CK 活性计算

1、按微量石英比色皿计算

(1) 按组织蛋白浓度计算：

酶活定义：37℃，pH7.0时，每毫克蛋白质每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。

CK活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(V样×Cpr) ÷T=268×ΔA÷Cpr

(2) 按组织样本质量计算：

酶活定义：37℃，pH7.0时，每克样本每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。

CK活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(V样÷V样总×W) ÷T=268×ΔA÷W

(3) 按血清体积计算：

酶活定义：37℃，pH7.0时，每mL血清每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。

CK活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷V样÷T=268×ΔA

(4) 按细胞数量计算：

酶活定义：37℃，pH7.0时，每1万个细胞每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。

CK活性（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T=268×ΔA÷细胞数量

ε：NADPH的摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；V样：反应体系中样本体积，0.04mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；细胞数量：以10⁴为单位计算，万个；T：反应时间，3min；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

2、按96孔UV板计算

将上述公式中的d=1cm改为0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。

注意事项：

1. 血清的CK不稳定，采集样本后尽快测定，4℃避光保存可稳定24h。

2. 样本蛋白质含量需要另外测定。

3. OD 值大于0.6可用提取液适当稀释样本，并在计算公式中相应的改变稀释倍数。

4. ΔA空白管一般不超过0.01。

实验实例：

1、 取0.1g小鼠脑加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后再用提取液稀释8倍，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.4175-0.1314=0.2861，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.1304-0.1256=0.0048，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.2861-0.0048=0.2813，按组织样本质量计算得：

CK活性（U/g 质量）=268×ΔA÷W×8（稀释倍数）=268×0.2813÷0.1×8（稀释倍数）=6031.072 U/g 质量。

2、 取兔血清直接检测，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.5761-0.4649=0.1112，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.1304-0.1256=0.0048，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.1112-0.0048=0.1064，按血清体积计算得：CK活性（U/mL）=268×ΔA=268×0.1064=28.5152 U/mL。

相关发表文献：

[1] Defang Li, Ning Lu, Jichun Han,et al. Eriodictyol Attenuates Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury through the Activation of JAK2. Frontiers in Immunology. January 2018;(IF3.845)

[2] Xu Y, Meng X, Hou X, et al. A mutant of the Buthus martensii Karsch antitumor-analgesic peptide exhibits reduced  inhibition to hNav1. 4 and hNav1. 5 channels while retaining analgesic activity[J].Journal of Biological Chemistry, 2017,  292(44): 18270-18280

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