NADH氧化酶(NOX)活性检测试剂盒 微量法

NADH氧化酶
（NOX）活性检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC0635
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：
试剂六：临用前加入4.5 mL双蒸水，用不完的试剂-20℃分装保存。
产品说明：
NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD⁺。该酶不仅参与NAD⁺的再生，而且与免疫反应密切相关。
NOX能够将NADH氧化为NAD⁺，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件
注意事项：
1、粗酶液的提取必须在0℃- 4℃中操作完成，以防止酶变性失活。
2、比色皿中反应液的温度最好保持37℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4、实验时，试剂六样本在冰上放置，以免变性和失活。
5、因通过反应速率计算酶活，使用96孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数量。
6、推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
7、附：使用样本质量计算公式
A、按微量玻璃比色皿计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX上清活性（U/g 质量）=ΔA1÷0.01×V反总÷(W÷V提取×V样)÷T=2525×ΔA1÷W
NOX沉淀活性（U/g 质量）=ΔA2÷0.01×V反总÷(W÷V样总×V样)÷T=505×ΔA2÷W
NOX活性（U/g 质量）= NOX上清+ NOX沉淀=2525×ΔA1÷W+505×ΔA2÷W
ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应总体积，0.25mL；V样：加入样本体积，0.01mL；V提取：加入试剂一体积，1.01mL；V样总：沉淀重悬体积，0.202mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min。
B、按96孔UV板计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。
NOX上清活性（U/g 质量）=ΔA1÷0.005×V反总÷(W÷V提取×V样)÷T=5050×ΔA1÷W
NOX沉淀活性（U/g 质量）=ΔA2÷0.005×V反总÷(W÷V样总×V样)÷T=1010×ΔA2÷W
NOX活性（U/g 质量）= NOX上清+ NOX沉淀=5050×ΔA1÷W+1010×ΔA2÷W
ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应总体积，0.25mL；V样：加入样本体积，0.01mL；V提取：加入提取液体积，1.01mL；V样总：沉淀重悬体积，0.202mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min。
实验实例：

1. 取0.1g肺进行样本处理，按照测定步骤操作，用微量玻璃比色皿测得ΔA1=ΔA测定-ΔA对照=（0.8136-0.118）-（0.9216-0.8079）=0.5819，ΔA2=ΔA测定-ΔA对照=（0.8546-0.4736）-（0.9539-0.9121）=0.3392，按样本质量计算酶活得：

NOX上清活性（U/g 质量）=2525×ΔA1÷W=2525×0.5819÷0.1=14692.975
NOX沉淀活性（U/g 质量）=505×ΔA2÷W=505×0.3392÷0.1=1712.96
NOX活性（U/g 质量）=NOX上清+NOX沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
=2525×0.5819÷0.1+505×0.3392÷0.1=16405.935 U/g 质量。

1. 取0.1g叶片进行样本处理，按照测定步骤操作，用微量玻璃比色皿测得ΔA1=ΔA测定-ΔA对照=（0.8518-0.7998）-（0.886-0.8831）=0.0491，ΔA2=ΔA测定-ΔA对照=（0.872-0.8296）-（0.916-0.9149）=0.0413，按样本质量计算酶活得：

NOX上清活性（U/g 质量）=2525×ΔA1÷W=2525×0.0491÷0.1=1239.775
NOX沉淀活性（U/g 质量）=505×ΔA2÷W=505×0.0413÷0.1=208.565
NOX活性（U/g 质量）=NOX上清+NOX沉淀=2525×ΔA1÷W +505×ΔA2÷W
=2525×0.0491÷0.1+505×0.0413÷0.1=1448.34 U/g 质量。
相关发表文献：

1. Dou S, Liu S, Xu X, et al. Octanal inhibits spore germination of Penicillium digitatum involving membrane peroxidation[J]. Protoplasma, 2017, 254(4): 1539-1545.

2. Liu P, Zhang H M, Hu K, et al. Sensory plasticity of carotid body is correlated with oxidative stress in paraventricular nucleus during chronic intermittent hypoxia[J]. Journal of cellular physiology, 2019, 234(8): 13534-13543.

3. Yongtao Du,Mengjie Zhao,Changtao Wang,et al. Identification and characterization of GmMYB118 responses to drought and salt stress. BMC Plant Biology. December 2018;(IF3.67)

1. Youqiang Xu,Chunyan Xu,Xiuting Li,et al. A combinational optimization method for efficient synthesis of tetrame thylpyrazine by the recombinant Escherichia coli. Biochemical Engineering Journal. January 2018;(IF3.371)

2. Weida Li,Kai Wang,Nanfang Jiang,et al. Antioxidant and antihyperlipidemic activities of purified polysaccharides from Ulva pertusa. Journal of Applied Phycology. April 2018;(IF4.784)

参考文献：

1. Kawai S, Mori S, Mukai T, et al. Cytosolic NADP phosphatases I and II from Arthrobacter sp. strain KM: implication in regulation of NAD⁺/NADP⁺ balance[J]. Journal of Basic Microbiology: An International Journal on Biochemistry, Physiology, Genetics, Morphology, and Ecology of Microorganisms, 2004, 44(3): 185-196.

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