糜*白酶活性检测试剂盒 微量法

糜*白酶活性检测
试剂盒说明书
微量法
货号：BC2335
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前溶于1.6 mL甲醇中，再用水定容至10 mL。可分装后-20℃保存，避免反复冻融。

产品说明：
糜*白酶，又称胰凝*蛋白酶，是胰腺分泌的一种蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质。糜*白酶的功能与胰蛋*酶相似，但是具有分解能力强、毒性低和不良反应小等优点。临床上糜*白酶用于痰液稀化，对脓性和非脓性痰液均有效；也用于创伤或手术后伤口愈合，如白内障摘除。
糜*白酶催化BTEE水解，产物在256nm有特征光吸收；通过测定256nm光吸收增加速率，来计算糜*白酶活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/ 96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）1：5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清即粗酶液。

2. 血清（浆）：直接检测。

• 测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至256nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一置于25℃水浴中保温30min。

3. 样本测定：

将上述试剂分别加入微量石英比色皿/96孔UV板后充分混匀，于256nm处测定初始吸光值A1和3min时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

• 糜*白酶活性计算公式

1. 按微量石英比色皿计算：

1、按样本蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃每毫克蛋白每分钟水解1μmol BTEE为一个酶活单位。
糜*白酶活(U/mg prot)=(ΔA×V反总÷ε÷d) ÷(Cpr×V样)÷T=3.8×ΔA÷Cpr

1. 按样本质量计算

活性单位定义：25℃每克样本每分钟水解1μmol BTEE为一个酶活单位。
糜*白酶活(U/g 质量)= (ΔA×V反总÷ε÷d) ÷(W×V样÷V 提取)÷T=3.8×ΔA÷W

1. 按血清（浆）体积计算

活性单位定义：25℃每毫升血清（浆）每分钟水解1μmol BTEE为一个酶活单位。
糜*白酶活(U/mL )=(ΔA×V反总÷ε÷d)÷V样÷T=3.8×ΔA
V样：加入反应体系中粗酶液体积，0.02mL；Cpr：粗酶液蛋白浓度，mg/mL，需要另外测定；W：样本质量，g；V反总：反应总体积，0.22mL；V提取：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，3min；ε：BTEE消光系数，0.964mL/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm。

1. 按96孔UV板计算：

将上述计算公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。
注意事项：

1. 当ΔA大于0.15或者吸光值大于1时，建议将样本用提取液稀释后测定，注意计算公式中乘以稀释倍数。

2. 当ΔA小于0.04时，建议将样本浓缩或者增加样本体积进行测定，注意计算公式除以浓缩倍数或者改变体积。

实验实例：

1. 取0.1g兔肾脏加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清后再用提取液稀释10倍，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA=A2-A1=0.9955-0.9192=0.0763，按样本质量计算酶活得：糜*白酶活(U/g 质量)=3.8×ΔA÷W×10（稀释倍数）=28.994 U/g 质量。

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