淀粉脱分支酶活性检测试剂盒 微量法

淀粉脱分支酶（DBE）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC4255
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前取1支加入1.5 mL试剂一，充分溶解后待用，用不完的试剂2-8℃保存4周；

2. 标准品：10 mg无水*萄糖。临用前加入1 mL蒸馏水溶解，配成10 mg/mL葡萄糖溶液备用，2-8℃可保存两周；

产品说明：
淀粉脱分支酶（starch debranching enzyme，DBE）能够专一、高效的裂解支链淀粉的α-1,6-糖苷键，对淀粉的结构起“修饰"的作用，淀粉脱分支酶在调整支链淀粉侧链的链长方面起着关键作用，淀粉分支酶和淀粉脱分支酶的平衡使得支链淀粉合成。

DBE催化支链淀粉产生还原糖，其与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕红色物质，通过测定其在540nm下吸光值变化可计算得DBE活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式低温离心机、水浴锅或恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积（mL）为1︰5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后15000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
2、细胞或细菌：按照细胞或细菌数量（10⁴个）︰提取液体积（mL）为500~1000︰1的比例（建议500万个细胞或细菌加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后15000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3、液体：直接检测。（若溶液有浑浊则离心后取上清测定）
二、测定步驟

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 将10 mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1mg/mL的标准溶液备用。

实验中每个标准管需40µL标准溶液。

1. 取100μL样本沸水浴5min（盖紧，防止水分散失），冷却至室温后，8000g，常温离心5min，取上清备用。

2. 操作表 (在0.5mL或1.5mL离心管中) ：

注意：37℃水浴或恒温培养箱中反应2h后，离心管底部可能有沉淀，无需离心，直接进入下一步试验即可。
三、DBE活性计算

1. 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程得到x（mg/mL）。

1. DBE活性的计算：

（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活（U/mg prot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T=0.5x×Cpr
（2）按样本质量计算
酶活定义：每克样本每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活（U/g质量）=x×V提取÷W÷T=0.5x÷W
（3）按细胞或细菌数量计算
酶活定义：每10⁴个细胞每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活（U/10⁴ cell）=x×V提取÷细胞数量（万个）÷T=0.5x÷细胞数量（万个）
（4）按液体体积计算
酶活定义：每mL样本每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活（U/mL）=x×V样÷V样÷T=0.5x
V提取：提取液体积，1mL；V样：加入的样本体积，0.04mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：2h。
注意事项：

1. A大于1.5时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。

2. 建议每次实验沸水浴后冷却时间保持一致。

实验实例：

1. 取0.1g大米，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，然后15000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测，取上清后再用提取液稀释10倍，之后按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA=A测定管-A对照管=0.243-0.111=0.132，标准曲线y=1.3913x-0.138，计算x=0.194，按样本质量计算酶活得：

DBE酶活（U/g质量）=0.5x÷W×10（稀释倍数）=9.7 U/g质量。
相关系列产品：
BC2040/BC2045  β-淀*酶（β-AL）活性检测试剂盒
BC1850/BC1855  可溶性淀粉合成酶（SSS）活性检测试剂盒
BC3290/BC3295  结合态淀粉合成酶（GBSS）活性检测试剂盒
BC1860/BC1865  淀粉分支酶（SBE）活性检测试剂盒

淀粉脱分支酶活性检测试剂盒 微量法 淀粉脱分支酶活性检测试剂盒 微量法