纤维素（CLL）含量检测试剂盒 微量法

纤维素（CLL）含量检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC4285
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液一：80%乙醇400 mL，即将320 mL无水乙醇和80 mL蒸馏水混合，自备。提供一个125 mL空瓶。

2. 标准品：10 mg葡萄糖。临用前加入1 mL蒸馏水溶解，配成10 mg/mL葡萄糖溶液备用，2-8℃保存两周。

3. 工作液的配制：取一瓶试剂一中加入2.5 mL试剂二，充分混匀，如较难溶解，可充分震荡或加热搅拌；用不完的试剂可以2-8℃保存一周。

产品说明：
纤维素是由β-D-葡萄糖单元以 β-1,4-糖苷键连接而成的直链多聚体，通常与半纤维素、果胶及木质素结合在一起，是植物细胞壁的主要结构成分。以纤维素为原料的产品广泛应用于食品、造纸、塑料、电工及科研器材等领域。纤维素在酸性条件下加热能分解成β-D-葡萄糖。在强酸作用条件下利用与蒽酮显色剂测定纤维素含量。

技术指标：
低检出限：0.0037 mg/mL
线性范围：0.00391-0.3 mg/mL
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式低温离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰盒、B酮、浓硫酸、无水乙醇、蒸馏水和EP管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
 

1. 细胞壁物质（CWM）的提取：

1. 称取约0.3g（记为W1）样本，加入1mL提取液一，室温快速匀浆，90℃水浴20min，冷却至室温，6000g，25℃离心10min，弃上清。

2. 沉淀先后用1.5mL提取液一和B酮各洗两遍（涡旋振荡2min左右，6000g，25℃离心10min，弃上清即可），沉淀即为粗细胞壁。

3. 在粗细胞壁中加入1mL提取液二（去除淀粉）浸泡15小时，6000g，25℃离心10min，弃上清，将沉淀用蒸馏水清洗两遍（涡旋振荡2min左右，6000g，25℃离心10min，弃上清即可），之后干燥沉淀（60-100℃均可），得到细胞壁物质（CWM），称重记为W2。

1. 纤维素的提取：

1. 称取烘干的CWM约 5mg（记为W3），加入0.5mL蒸馏水充分匀浆，匀浆液转移至EP管中，用蒸馏水定容至0.5mL。

2. 将定容后的匀浆液置于冰水混合物中，缓慢加入0.75mL浓硫酸，缓慢混匀，冰水浴中静置30min。8000g，4℃离心10min，取上清液，用蒸馏水稀释20倍后待测。

注意：1. 若样本或者干燥后的沉淀质地坚硬，可以先研碎再进行后续步骤
2. 在提取纤维素的过程中，首先，置于冰水浴中的EP管需要固定，不要上下左右浮动，一方面保障自身安全，另一方面防止冰水混合物进入EP管造成试验误差；再者，加入浓硫酸时，建议枪头伸入样本液面以下，缓慢加入，防止液面沸腾及样本碳化。
二、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至620nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 将10mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078、0.0039mg/mL的标准溶液备用。

3. 标准品稀释表

实验中每个标准管需150µL标准溶液。

1. 操作表 (在1.5 mL离心管中) ：

三、纤维素含量计算
1、标准曲线的绘制：
根据标准管的浓度（x，mg/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA（y，ΔA）带入公式计算样本浓度（x，mg/mL）
2、纤维素含量的计算：
（1）按样本质量计算
纤维素（mg/g 质量）=x×V提取×20×（W2÷W3）÷W1÷1.11=22.52×x×W2÷W3÷W1
（2）按样本细胞壁物质（CWM）质量计算
纤维素（mg/g 干重）=x×V提取×20÷W3÷1.11=22.52x÷W3
1.11：是此法测得葡萄糖含量换算为纤维素含量的常数，即111 µg葡萄糖用蒽酮试剂显色相当于100 µg纤维素蒽酮试剂所显示的颜色；V提取：纤维素提取液体积，1.25 mL（0.5 mL蒸馏水+0.75 mL浓硫酸）；20：样本稀释倍数；W1：样本质量，0.3 g；W2：样本细胞壁物质（CWM）质量，g；W3，提取纤维素时称取的细胞壁物质（CWM）质量，g。
注意事项：

1. 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

2. 浓硫酸具有强腐蚀性，操作时各个步骤均需特别注意：纤维素提取在加入浓硫酸时，建议枪头伸入样本液面以下，缓慢加入，以防止液体飞溅烧伤；95℃水浴结束取出后需冷却至室温再打开EP管盖，以防液体飞溅烧伤。

3. 由于试剂二挥发性强且具有刺激性气味，建议在通风橱中进行工作液的配制。

实验实例：

1. 取0.3g康乃馨叶片样本提取细胞壁物质（CWM）0.02g，称取烘干的CWM约 5mg（记为W3），提取纤维素，取上清液，用蒸馏水稀释20倍后进行检测，用96孔板测得计算ΔA=A测定管-A空白管=0.538-0.061=0.477，标准曲线y=8.3536x+0.0388，计算x=0.05246，按样本质量计算得：

纤维素（mg/g 质量）=22.52×x×W2÷W3÷W1=15.752 mg/g 质量。

1. 取0.3g黑麦草样本提取细胞壁物质（CWM）0.04g，称取烘干的CWM约 5mg（记为W3），提取纤维素，取上清液，用蒸馏水稀释20倍后进行检测，用96孔板测得计算ΔA=A测定管-A空白管=0.666-0.061=0.605，标准曲线y=8.3536x+0.0388，计算x=0.06778，按样本质量计算得：

纤维素（mg/g 质量）=22.52×x×W2÷W3÷W1=40.704 mg/g 质量。
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