肝脂酶（HL）检测试剂盒 脂肪酸代谢

肝脂酶（HL）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC2380
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：
1、试剂三：临用前加入30 mL蒸馏水，充分溶解待用，用不完的 2-8℃保存8周；
2、试剂四：临用前取1瓶加入2 mL蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂可-20℃分装保存2周，避免反复冻融；
3、标准品：临用前加入6.94 mL丙 酮，配成10 μmol/mL α-萘酚标准溶液，充分溶解待用，用不完的-20℃保存4周。
产品说明：
肝脂酶（hepaticlipase，HL）是一种脂肪分解酶，在肝实质细胞中合成，存在于肝脏窦周间隙内皮细胞表面和窦周间隙腔面的肝细胞微绒毛表面，可水解各种脂蛋白中的甘油三酯（TG）和磷脂（PL），使各种脂蛋白颗粒的大小和密度发生变化，当血浆中的HL及其活性增高时，可导致血浆中低密度脂蛋白（LDL）水平升高，加速动脉粥样硬化的发生与发展。
肝脂酶水解α-乙酸萘酯产生α-萘酚，可与固蓝B盐形成紫红色偶氮化合物，在595 nm有特征吸收峰，其颜色深浅在一定范围内与肝脂酶活性成正相关。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、天平、低温离心机、水浴锅、1 mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、EP管、 丙 酮、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照质量（g）︰试剂一体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取样本约0.1g，加入1mL试剂一），加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃，10000 g离心10 min，取上清待测。
2、细胞：按照细胞数量（10⁴个）︰试剂一体积（mL）为500~1000︰1的比例（建议500万细胞加入1 mL试剂一）加入试剂一，冰浴超声波破碎细胞（功率300W，超声3秒，间隔7秒，总时间3 min）；然后于4℃，10000g离心10 min，取上清待测。
3、血清/血浆：直接检测。（若液体有浑浊则离心后进行测定）
二、测定步骤

1. 分光光度计预热30 min以上，调节波长至595 nm，用蒸馏水调零。

2. 将试剂一在30℃预热20 min以上。

3. 将10 μmol/mL 的标准溶液用试剂一稀释为1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078 μmol/mL的标准溶液备用。

4. 标准品稀释表

实验中每个标准管需100µL标准溶液。

1. 操作表：(在1.5 mL离心管中依次加入下列试剂)

三、HL酶活计算

1. 标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA（y，ΔA）带入公式计算样本浓度（x，μmol/mL）。

1. HL酶活的计算：

（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟水解α-乙酸萘酯产生1 μmol的 α-萘酚为一个酶活力单位。
HL活性（U/mg prot）=x×V样÷（V样×Cpr）÷T=0.1x÷Cpr
（2）按样本质量计算
酶活定义：每克组织每分钟水解α-乙酸萘酯产生1 μmol的 α-萘酚为一个酶活力单位。
HL活性（U/g 质量）=x×V样÷（W×V样÷V样总）÷T=0.1x÷W
（3）按照细胞数量计算
酶活定义：每10⁴个细胞每分钟水解α-乙酸萘酯产生1 μmol的 α-萘酚为一个酶活力单位。
HL活性（U/10⁴ cell）=x×V样÷（V样×N÷V样总）÷T=0.1x÷N
（4）按液体体积计算
酶活定义：每毫升血清/血浆每分钟水解α-乙酸萘酯产生1μmol的 α-萘酚为一个酶活力单位。
HL活性（U/mL）=x×V样÷V样÷T=0.1x
V样：反应体系中加入样本体积，0.1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；V样总：加入试剂一体积，1 mL；T：反应时间，10 min；N：细胞数量，以万计。
注意事项：

1. 若样本为动物肝脏，建议将样本用试剂一稀释25倍以上再进行检测，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2. 若样本为肥胖型动物血清或血浆，建议将样本用试剂一稀释5倍以上再进行检测，并在计算公式中乘以稀释倍数。

3. 当ΔA大于0.8时，建议将样本用试剂一稀释后再进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

实验实例：

1. 取0.1g大鼠肝脏，进行样本处理，取上清稀释48倍后按照操作步骤进行操作，测得计算ΔA=A测定管-A对照管=0.713-0.001=0.712，带入标准曲线y = 0.6381x - 0.0005，计算x=1.1166，按照样本质量计算酶活得：HL活性（U/g 质量）=x×V样÷（W×V样÷V样总）÷T×48=53.597 U/g 质量。

2. 取火鸡血清稀释12倍后按照操作步骤进行操作，测得计算ΔA=A测定管-A对照管=0.572-0.003=0.569，带入标准曲线y = 0.6381x - 0.0005，计算x=0.892，按照液体体积计算酶活得：HL活性（U/mL）=x×V样÷V样÷T×12=1.071 U/mL。

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