丙酮酸羧化酶（PC）活性检测试剂盒 微量法

丙酮酸羧化酶（PC）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号: BC0735

规格: 100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂三：临用前加入3 mL蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存2周，避免反复冻融；

2、 试剂四：临用前加入2 mL蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存2周，避免反复冻融；

3、 试剂六：临用前加入0.13mL试剂六稀释液溶解，可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融；

4、 试剂六工作液：临用前根据样本量按试剂六：试剂六稀释液=0.01mL：0.3mL（共0.31mL，约15T）的比例进行配制，现用现配，当天用完；

5、 工作液的配制：按照试剂二：试剂三：试剂四=2:1:1的体积比例充分混匀，现用现配。

产品说明：

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。是供给草酰乙酸的主要补充反应，是糖异生过程的第一个限速酶。

PC不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO₂和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和 NADH生成苹果酸和NAD⁺，在340nm下测定NADH氧化速率，即可反映PC活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤;

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 4℃1000g离心10min。将上清液移至另一离心管中，4℃11000g离心15min。

3、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PC（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4、 在沉淀中加入1mL提取液，超声波破碎（功率200W，超声5秒，间隔10秒，重复12次），用于PC活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 试剂一用前37℃孵育15min。

3、 操作表：

三、PC酶活计算

1. 按微量石英比色皿计算：

单位的定义：每毫克蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。

PC酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 1607×ΔA÷Cpr

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；V样：反应体系中样本体积，0.01mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间：2min。

2. 按96孔UV板计算：

将上述计算公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。

注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，ΔA大于0.8时（96孔UV板测定时ΔA大于0.5时），建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时，可以延长反应时间（5min或10min）来测定。

2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.05。

3. 样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有较高的蛋白浓度（约1mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。

4. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

5. 本试剂盒试剂足够完成100管反应。

6. 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为100T/48S）

（1）按微量石英比色皿计算：

A、上清中PC活力的计算:

按样本质量计算：

酶活定义：每克样本每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PC酶活（U/g质量）=ΔA1÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T = 1607×ΔA1÷W

ΔA1：上清测定值；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；V样：反应体系中样本体积，0.01mL；V提取：加入的提取液体积，1mL；T：反应时间：2min；W：样本质量，g。

B、沉淀中PC活力的计算:

按样本质量计算：

酶活定义：每克样本每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PC酶活（U/g质量）=ΔA2÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T = 1607×ΔA2÷W

ΔA2：上清测定值；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；V样：反应体系中样本体积，0.01mL；V提取：沉淀重悬体积，1mL；T：反应时间：2min；W：样本质量，g。

C、样本PC总活力的计算:

样本PC总活力即为上清中PC活力与沉淀中PC活力之和。

按样本质量计算：

PC（U/g 质量）=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W。

（2）按96孔UV板计算：

将上述计算公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。

实验实例

1、 取0.1g兔心组织加入1mL提取液进行匀浆研磨，用提取液稀释上清100倍，稀释沉淀4倍，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算上清中的ΔA测定管=A1测定-A2测定=1.0091-0.7487=0.2604，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.9948-0.9678=0.027，ΔA1=ΔA测定管-ΔA空白管=0.2604-0.027=0.2334，沉淀中的ΔA测定管=A1测定-A2测定=1.08-0.6157=0.4643，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.9948-0.9678=0.027，ΔA2=ΔA测定管-ΔA空白管=0.4643-0.027=0.4373，按样本质量计算酶活得：

上清：PC的酶活（U/g 质量）= 1607×ΔA1÷W×100(稀释倍数)=1607×0.2334÷0.1×100=375073.8 U/g 质量；

沉淀：PC的酶活（U/g 质量)=1607×ΔA2÷W×4(稀释倍数)=1607×0.4373÷0.1×4=28109.64 U/g 质量；

PC总酶活（U/g 质量）=1607×ΔA1÷W×100(稀释倍数)+1607×ΔA2÷W

=1607×0.2334÷0.1×100+1607×0.4373÷0.1×4=403183.44 U/g 质量。

相关发表文献：

[1] Esmail S. Kakey,Amez A. Ismael. Evaluation of Oxidative Stress Status in Aged Human in relation to some Diseases. International Conference on Pure and Applied Sciences. August 2018;

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