乙酰辅*A含量检测试剂盒 微量法

乙酰辅*A含量检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0985

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前加入163μL试剂四，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；

2、 试剂二：临用前取1支先将液体甩离至管底，然后加入125μL试剂四，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；

3、 试剂三：临用前取1瓶试剂三B加入12mL试剂三A，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；

4、 工作液：临用前将试剂一、二和三按照1:1:90的比例混合，根据样本量现配现用。

产品说明：

乙酰辅*A广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物，在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅*A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路氧化生成二氧化碳和水，释放能量用于ATP合成。此外，乙酰辅*A是合成脂肪酸、酮体、胆*醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。

苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD⁺生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅*A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅*A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅*A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅*A含量的高低。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、天平、水浴锅/恒温培养箱、台式低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：建议称取约0.1g样本，加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二进行冰浴匀浆。于4℃，8000g离心10min，取上清，置于冰上待测。

2. 细胞或细菌：建议取500万细胞或细菌加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二，冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率200w，超声3秒，间隔10秒，重复30次），于4℃，8000g离心10min，取上清，置于冰上待测。

3. 血清（浆）或其他液体：直接检测，若液体有浑浊则离心后测定。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 将工作液37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热10min。

3. 取50μL样本和205μL工作液至微量石英比色皿或96孔UV板，混匀，立即记录340nm处20s的吸光值A1和80s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

三、乙酰辅*A含量计算

A、使用微量石英比色皿测定

1. 按样本质量计算

乙酰辅*A含量（nmol/g 质量）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×10⁹÷V样×V提÷W×F=819.9×ΔA÷W×F

2. 按照细胞数量计算

乙酰辅*A含量（nmol/10⁴ cell）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×10⁹÷V样×V提÷500×F=1.640×ΔA×F

3. 按液体体积计算

乙酰辅*A含量（nmol/mL）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×10⁹÷V样×F=819.9×ΔA×F

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；V反：反应总体积，2.55×10^-4L；V样：加入样本上清体积，0.05mL；V提：加入提取液一和提取液二的总体积，1mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌数量，500万；F：稀释倍数。

B、使用96孔UV板测定

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。

实验实例：

1. 称取0.1g兔肾加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二进行匀浆研磨，离心后取上清，稀释2倍后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA= A2-A1=0.8083-0.7691=0.0392，按样本质量计算酶活得：

乙酰辅*A含量（nmol/g 质量）＝819.9×0.0392÷0.1×2=642.8 nmol/g 质量。

相关系列产品：

BC0710/BC0715  α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）活性检测试剂盒

BC2150/BC2155 柠檬酸（CA）含量检测试剂盒

BC0950/BC0955 琥珀酸脱氢酶（SDH）活性检测试剂盒

BC0380/BC0385 丙 酮酸脱氢酶（PDH）活性检测试剂盒

BC2160/BC2165 线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）活性检测试剂盒

乙酰辅*A含量检测试剂盒 微量法 乙酰辅*A含量检测试剂盒 微量法