果糖-1,6-二磷酸含量检测试剂盒 微量法

果糖-1,6-二磷酸（FDP）含量检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC2245

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前取一支加入0.15 mL蒸馏水，充分溶解后待用，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

2、 标准品：临用前加入1176 μL 蒸馏水充分溶解，配制成50 μmol/mL果糖-1,6-二磷酸标准溶液，2-8℃可以保存4周。

产品说明：

果糖1,6-二磷酸（fructose-1,6-diphosphate, FDP）是糖酵解过程中的一种重要的中间产物，对多种酶具有调节作用，具有改善细胞能量代谢、增加能量利用、抗心律失常及抗组织过氧化等作用，广泛应用于临床医药。

醛缩酶催化果糖1,6-二磷酸裂解，产物与2,4-二* 苯 肼在酸性介质中反应生成2,4-二*苯腙，在碱性溶液中呈红棕色，在540 nm处有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰、蒸馏水和EP管。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

血清（浆）等液体：取100μL液体加入1mL提取液一，4℃ 12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

注：提取液二需缓慢加入，加入后会产生大量气泡，建议使用2mL EP管进行操作。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 将50µmol/mL的果糖-1,6-二磷酸标准液用蒸馏水倍比稀释为3.125、1.5625、0.78125、0.39、0.2、0.1 µmol/mL的标准溶液备用。

3、 标准品稀释表：

实验中每个标准管需40µL标准溶液。

4、 样本测定：(在1.5 mL离心管或96孔板中操作)

三、FDA含量计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y= kx+b，将ΔA带入方程得到x（µmol/mL）。

2、FDP含量的计算：

（1）按样本质量计算

FDP含量（µg/g 质量）=x×(V上清+V提取液二)×M÷(W×V上清÷V提取液一)=403.75x÷W

（2）按细胞数量计算

FDP含量（µg/10⁴ cell）=x×(V上清+V提取液二)×M÷(V上清÷V提取液一×N)=403.75x÷N

（3）按液体体积计算

FDP含量（µg/mL）=x×（V上清+V提取液二）×M÷ [V液体×V上清÷（V提取液一+V液体）]=4441.25x

V上清：提取时上清液体积，0.8mL；V提取液二：提取液二的体积，0.15mL；V提取液一：提取液一的体积，1mL；W：样本质量，g；M：果糖-1,6-二磷酸分子质量，340；V液体：液体样本体积，0.1mL；N：细胞数量，以万计。

注意事项：

当ΔA测定大于0.5时，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。

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