果胶裂解酶活性检测试剂盒 微量法

果胶裂解酶（PL）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号: BC2645

规格: 100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 工作液：将试剂一倒入试剂二于50℃水浴中溶解（期间可拿出振荡数次）。该试剂易长菌，配制完成后可-20℃分装保存，可保存12周。

产品说明：

果胶裂解酶（EC4.2.2.10）是果胶酶的重要组成部分，催化果胶分子链的消除裂解。来源比较广泛，主要来源于微生物，在食品加工工业中提高果汁产量方面有重要意义，在减少环境污染和降低能源消耗方面也具有潜在的应用价值。

果胶裂解酶作用于果胶中的α-1,4糖苷键，生成在还原端C4和C5之间位置具有不饱和键的不饱和寡聚半乳糖醛酸，在235nm处有特征吸收峰，测定235nm下吸光度的上升来表示果胶裂解酶的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 细胞、细菌或真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。（细菌、真菌等难以数量计算的微生物也可以称取0.1g 细菌/真菌沉淀来进行前处理）

3. 培养液：直接测定。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至235nm，蒸馏水调零。

2、 操作表：

三、果胶裂解酶活性计算

A、按微量石英比色皿计算：

1. 按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每毫克蛋白每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

PL活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×Cpr）÷T=64.1×ΔA÷Cpr

2. 按照样本质量计算

酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每克组织每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

PL活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×W÷V样总）÷T= 64.1×ΔA÷W

1. 按照细菌、真菌货细胞数量计算

酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每10⁴个细胞每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

PL活性（U/10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×N÷V样总）÷T= 64.1×ΔA÷N

3. 按照培养液体积计算

酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每毫升培养液每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

PL活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷V样÷T= 64.1×ΔA

ε：不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数，5200 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.0002 L；V样：反应体系中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min；10⁹：换算系数，1mol=10⁹nmol；N：细胞数量，以万计。

B、按96孔UV板计算：

将上述公式中的d-1cm修改为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。

注意事项：

1、 若A1测定管大于1.5或者ΔA大于0.5，将样本粗酶液用蒸馏水稀释后再进行测定。

2、 建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。

3、 空白管正常情况下变化不超过0.02。

实验实例：

1、 取0.1g香蕉皮加入1mL提取液进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。之后按照测

定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管= A2测定管-A1测定管=0.528-0.5254=0.0026，ΔA=

ΔA测定管-ΔA空白管=0.1551-0.1542=0.0009，按样本质量计算酶活得：

PL活性（U/g 质量）= 64.1×ΔA÷W=1.090 U/g 质量。

2、 取0.1g大肠杆菌沉淀加入1mL提取液冰浴超声波破碎细胞，然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管= A2测定管-A1测定管=1.2213-0.8277=0.3936，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.1551-0.1542=0.0009，按照样本质量计算酶活得：

3、 PL活性（U/g 质量）= 64.1×ΔA÷W=251.721 U/g 质量。

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