糖化酶活性检测试剂盒 微量法

糖化酶活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC2675

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前取1瓶加入10 mL提取液，充分混匀后沸水浴直至溶解（约10min），2-8℃保存4周； 

2、 标准品：10 mg无水葡*糖，临用前加1 mL提取液溶解为10 mg/mL的葡萄糖标准品备用，2-8℃保存两周； 

产品说明：

糖化酶，即葡萄糖淀*酶（EC3.2.1.3），又称γ-淀*酶。糖化酶是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶，主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解α-1,6糖苷键由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。多应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。

糖化酶将可溶性淀粉生成葡萄糖，碱性条件下，葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后生成红棕色化合物，在540nm处有最大光吸收，在一定范围内葡萄糖的量与反应液颜色深浅成正比，以此测定糖化酶的活力。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪 、微量玻璃比色皿/96孔板、恒温水浴锅、研钵/匀浆器，超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清

置于冰上待测。

3. 培养液或其它液体：直接检测。（若有沉淀则离心后测定）

二、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 标准品准备：将标准品用蒸馏水稀释至2、1.5、1.0、0.8、0.4、0.2、0.1mg/mL。

实验中每个标准管需15µL标准溶液。

3. 吸取50μL样本于1.5mLEP管中沸水浴5min作为对照管的灭活样本。

4. 加样表：

三、糖化酶活性计算

1. 标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x，mg/mL）和吸光度ΔA标（y，ΔA标），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测（y，ΔA测）带入公式计算样本浓度（x，mg/mL）。

2. 酶活性计算：

（1）按照蛋白浓度计算：

酶活性定义：在40℃每毫克蛋白每小时产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/mg prot）=x×V样总÷（V样总×Cpr）÷T=3x÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活性定义：在40℃每克组织每小时产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/g 质量）= x×V样总÷ W÷T=3x÷W

（3）按照液体体积计算

酶活性定义：在40℃每毫升液体每小时产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/mL）= x×V样÷V样÷T=3x

（4）按照细胞数量计算

酶活性定义：在40℃每10⁴个细胞每小时产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/10⁴ cell）= x×V样总÷500÷T=0.006x

V样：反应体系中加入的样本体积，15μL=0.015mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间，20min=0.333h；500：细胞数量，500万。

注意事项：

测定之前进行预实验，若吸光值较高，请将样本用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

实验实例：

1、 取0.1g玉兰叶片加入1mL提取液冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上，之后按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测=A测定管-A对照管=0.501-0.396=0.105，带入标准曲线y=0.488x-0.003，计算x=0.221，按样本质量计算酶活得：

糖化酶活性（U/g 质量）=3x÷W=6.64 U/g 质量。

2、 取0.1g肝脏加入1mL提取液冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上，之后按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测=A测定管-A对照管=1.006-0.858=0.148，带入标准曲线y=0.488x-0.003，计算x=0.309，按样本质量计算酶活得：

糖化酶活性（U/g 质量）=3x÷W=9.27 U/g 质量。

3、 取兔血清按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测=A测定管-A对照管=1.045-0.481=0.564，带入标准曲线y=0.488x-0.003，计算x=1.162，按照液体体积计算：

糖化酶活性（U/mL）=3x=3.486 U/mL。

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