细胞壁结合酸性转化酶活性检测试剂盒

细胞壁结合酸性转化酶（CWI）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC4325

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入20 mL试剂一，充分溶解后待用；

2、 标准品：10 mg无水*萄糖。临用前加入1 mL蒸馏水充分溶解，配成10 mg/mL葡萄糖溶液备用，2-8℃保存一周。

产品说明：

蔗糖转化酶（Invertase，Inv）不可逆的催化蔗糖裂解形成葡萄糖和果糖，在植物蔗糖代谢中发挥着重要作用。Inv根据最适pH，可分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI），其中AI根据亚细胞定位的差异又可分为可溶性酸性转化酶（Soluble acid Invertase，SAI）和细胞壁结合酸性转化酶（Cell wall-bound acid Invertase，CWI）。 CWI以离子键的形式结合在细胞壁上，在“库"组织韧皮部蔗糖卸载、蔗糖质外运输、植物的生长发育以及抵抗各种胁迫中起着重要作用。

CWI催化蔗糖降解产生还原糖，还原糖与3,5 –二硝基水杨酸反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质，通过测定540nm处吸光值变化可计算得CWI活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式低温离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照质量（g）：提取液一体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，12000g，离心10min，弃上清，留沉淀；沉淀中加入1mL蒸馏水，充分震荡混匀，4℃，12000g离心10min，弃上清，留沉淀；沉淀中加入1mL提取液二，充分混匀，4℃浸提15h，4℃，12000g，离心10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步驟

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、 将10mg/mL标准液用蒸馏水稀释为2、1、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3mg/mL的标准溶液备用。

3、 操作表 (在1.5mL离心管中操作) ：

注意：如果样本在37℃反应后的95℃水浴步骤中出现沉淀，建议室温12000g，离心5min，取上清（若上清不足400µL，可按比例缩小加样体系，如300µL上清+150µL试剂三）进行下一步操作。

三、CWI活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程得到x（mg/mL）。

2、 CWI活性的计算：

（1）按蛋白浓度计算

酶活定义：37℃每mg蛋白每分钟分解蔗糖产生1µg还原糖为1个酶活力单位。

CWI酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）×10³÷T = 33.33x÷Cpr

（2）按样本质量计算

酶活定义：37℃每g样本每分钟分解蔗糖产生1µg还原糖为1个酶活力单位。

CWI酶活（U/g质量）= x×V提取×10³÷W÷T = 33.33x÷W

V提取：提取液二体积，1mL；10³：单位换算系数，1mg = 10³µg；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间，30min。

注意事项：

1. 当A或ΔA超过1.5时，建议将样本用提取液二稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。

2. 95℃水浴时EP管盖紧，防止水分散失，待冷却至室温后（建议每次实验后冷却时间保持一致），再进行下一步操作，避免液体飞溅烫伤以及影响试验数据。

实验实例：

1. 取0.1g丁香叶加入1mL提取液进行匀浆研磨，最后取上清后按照操作步骤操作，用96孔板测得A对照管=0.358，A测定管=0.566，标准曲线y=0.8552x-0.1864，A空白管=0.068，计算ΔA=A测定管-A对照管=0.566-0.358=0.208，x=（0.208+0.1864）÷0.8552=0.461，按样本质量计算酶活得：

CWI酶活（U/g质量）=33.33x÷W=33.33×0.461÷0.1= 153.711 U/g质量。

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