N-乙酰基-β-葡萄糖苷酶活性测试盒 糖代谢

N-乙酰-β-D -葡萄糖苷酶（NAG）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC4290

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前取一瓶加入2.5 mL蒸馏水溶解备用；可-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

2、 标准品：5 μmol/mL *溶液。

产品说明：

N-乙酰-β-D -葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.52，N-acetyl-β-D-glucosidase，NAG）广泛分布于各种组织中，是一种细胞内溶体酶，测定NAG活性可用于肾小管间质性肾炎、尿路感染、糖尿病肾病综合症、高血压肾病、肾移植后的排异反应和肾病综合症的早期诊断。

NAG分解N-β-乙酰氨基葡萄糖苷生成对-硝 基*酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定400nm下吸光度的变化来计算NAG活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、天平、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声破碎仪、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）:提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取0.1g组织，加入1mL提取液），冰浴匀浆。15000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、细菌、细胞：先收集细胞或细菌样本到离心管内，离心弃上清后，按照细胞数量10⁴个：提取液体积（mL）500~1000:1的比例，建议500万细胞加入1mL提取液），超声波破碎细胞（冰浴，功率200w，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后15000g，4℃，离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）等液体：直接测定。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。

2、 标准溶液的稀释：取125μL 5 μmol/mL对硝基 苯* 溶液，加入875μL蒸馏水，充分混匀，配制成0.625 μmol/mL标准液使用，现用现配。（实验中每管需要50μL，为减小实验误差，故配制大体积。）

3、 操作表 (在1.5mL离心管中依次加入下列试剂) ：

    混匀后室温放置2min，测定400nm的吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管。标准管和空白管只需测1-2次。

三、NAG活性计算

1、按蛋白浓度计算

活力单位定义：每mg蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol对硝基 苯*定义为一个酶活力单位。

NAG (U/mg prot) =ΔA测定÷（ΔA标准÷C标）×1000×V样÷（Cpr×V样）÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

2、按样本质量计算

活力单位定义：每g样本在反应体系中每分钟生成1nmol对硝基 苯*定义为一个酶活力单位。

NAG (U/g 质量)=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标）×1000×V样÷(V样÷V样总×W)÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷W

3、 按细胞数量计算

活力单位定义：每10⁴个细胞在反应体系中每分钟生成1nmol对硝基 苯*定义为一个酶活力单位。

NAG (U/10⁴ cell)= ΔA测定÷（ΔA标准÷C标）×1000×V样÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T

=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷细胞数量

4、按液体体积计算

活力单位定义：每毫升液体在反应体系中每分钟催化生成1nmol对硝基 苯*为一个酶活力单位。

NAG (U/mL)= ΔA测定÷（ΔA标准÷C标）×1000×V样÷V样÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准

C标：标准溶液浓度：0.625μmol/mL；V样：加入的样本体积，0.05mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，30min；细胞数量：以万计；W：样本质量，g；1000：换算系数，1μmol=1000nmol。

注意事项：

吸光度若大于1.2时，建议将样本用提取液稀释后进行测定。

实验实例：

1. 取0.1g大鼠脾脏组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。15000g，4℃离心10min，取上清稀释5倍，按照测定步骤操作，测定计算ΔA测定=A测定管-A对照管=0.798-0.042=0.756，ΔA标准=A标准管-A空白管=0.364-0.006=0.358，按样本质量计算得：

NAG（U/g 质量）=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷W×5（稀释倍数）=2199.3687 U/g 质量。

2. 取0.1g玉兰，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。15000g，4℃离心10min，取上清，按照测定步骤操作，测定计算ΔA测定=A测定管-A对照管=0.543-0.120=0.423，ΔA标准=A标准管-A空白管=0.364-0.006=0.358，按样本质量计算得：

NAG（U/g 质量）=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷W=246.120 U/g 质量。

3. 取兔血清直接检测，按照测定步骤操作，测定计算ΔA测定=A测定管-A对照管=0.542-0.348=0.194，ΔA标准=A标准管-A空白管=0.364-0.006=0.358，按液体体积计算得：

NAG（U/mL）=20.83×ΔA测定÷ΔA标准=11.2878 U/mL。

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