亚铁氧化酶（HP）活性检测试剂盒 抗氧化

亚铁氧化酶（HP）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC4340

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、试剂三：临用前加入7 mL蒸馏水溶解备用，用不完的试剂2-8℃保存4周。

2、标准品：9 µmol/mL的亚铁离子标准液。

产品说明：

亚铁氧化酶（Hsphasetin，HP）是铜蓝蛋白的同系物，催化亚铁离子（Fe²⁺）氧化为三价铁离子（Fe³⁺），从而三价铁与转铁蛋白结合，参与细胞铁释放。

以一定浓度的Fe²⁺ 为底物，在亚铁氧化酶的催化作用下Fe²⁺ 被氧化为Fe³⁺，Fe²⁺ 与菲咯嗪形成有色复合物，在562 nm处有特征吸收峰，先计算出未被氧化的Fe²⁺ 的含量，进而得出被氧化的Fe²⁺ 的含量，可通过Fe²⁺ 被氧化的速率来反映亚铁氧化酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照质量（g）︰蒸馏水体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1 g，加入1 mL蒸馏水）加入蒸馏水，冰浴匀浆后于10000 rpm，4℃离心10 min，取上清置于冰上待测。

2、血清或血浆：建议用蒸馏水将血清或血浆稀释2~4倍后直接检测。若溶液浑浊则离心取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30 min以上，调节波长至562 nm，蒸馏水调零。

2、 标准液的稀释：将9 µmol/mL的亚铁离子标准液用蒸馏水倍比稀释为360、180、90、45、22.5、11.25、5.625 nmol/mL的标准溶液备用。

3、 标准液稀释可参考下表：

备注：实验中每个标准管需100µL标准溶液。

4、 操作表：在1.5 mL离心管中依次加入下列试剂：

三、亚铁氧化酶活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度（nmol/mL）为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y= kx+b，将ΔA测定带入方程得到样本浓度（x，nmol/mL）。

2、 亚铁氧化酶活性的计算：

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活定义：每mg蛋白每分钟氧化1 nmol的Fe²⁺ 定义为1个酶活力单位。

亚铁氧化酶酶活（U/mg prot）= x×V试剂二÷（V样×Cpr）÷T ×N= 1.667x÷Cpr×N

（2）按照样本质量计算

酶活定义：每g样品每分钟氧化1 nmol的Fe²⁺ 定义为1个酶活力单位。

亚铁氧化酶酶活（U/g质量）= x×V试剂二÷（V样×W÷V提取）÷T×N = 1.667x÷W×N

（3）按液体体积计算

酶活定义：每mL样本每分钟氧化1 nmol的Fe²⁺ 定义为1个酶活力单位。

亚铁氧化酶酶活（U/mL）= x×V试剂二÷V样÷T ×N= 1.667x×N

V试剂二：加入的试剂二体积，0.1 mL；V样：加入的样本体积，0.02 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：3 min；N：稀释倍数。

注意事项：

1、当A测定低于0.1时，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。

实验实例：

1、 取0.1g脾脏，进行样本处理，按照测定操作步骤，测得计算ΔA测定=（A无基质管-A空白管）-（A测定管-A对照管）=（0.976-0.005）-（0.996-0.047）=0.022，带入标准曲线y = 0.0027x + 0.0036，计算x=6.815，按照样本质量计算酶活得：

亚铁氧化酶酶活（U/g质量）= 1.667×x÷W×N= 1.667×6.815÷0.1=113.603 U/g质量。

2、 取兔血清，按照测定操作步骤，测得计算ΔA测定=（A无基质管-A空白管）-（A测定管-A对照管）=（0.976-0.005）-（0.469-0.009）=0.511，带入标准曲线y = 0.0027x + 0.0036，计算x=187.926，按照液体体积计算酶活得：

亚铁氧化酶酶活（U/mL）= 1.667×x=1.667×187.926=313.273 U/mL。

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