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  • PCR纯化Kit
产品名称:

PCR纯化Kit

产品品牌: SOLARBIO/索莱宝 价格:
厂商性质: 生产厂家 产品时间: 2022-08-13
PCR纯化Kit
货号:D6492-01
规格:100/盒
品牌:omega
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。

产品概述

品牌SOLARBIO/索莱宝

PCR纯化Kit
货号:D6492-01
规格:100/盒
品牌:omega

 

     聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增十万乃百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

 

    PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性→退火→延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性→退火→延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

 

PCR反应体系:
    1、引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物浓度一般为0.1~0.5μM,这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30T。以低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会,但浓度过低则得不到产物或产量过低。

 

    2、Taq酶:目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,但保真度较差,在复制比较长的模板时容易发生点突变。另一种为在大肠杆菌合成的基因工程酶。能催化以DNA单链为模板,以碱基互补原则为基础,按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端,合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性,没有校正功能。催化一典型的PCR反应约需酶用量一般为0.5~5U/100μl,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

 

    3、dNTP:dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。多次冻融会使dNTP降解,一般存储浓度为10mM,小量分装,-20℃冷冻保存。在PCR反应中,dNTP浓度一般为50~200μM,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。高浓度dNTP可加速反应,但同时会增加错误掺入和实验成本;低浓度dNTP可提高PCR的性,但反应速度和PCR产物的产量会降低。dNTP能与Mg 2+ 结合,使游离的Mg 2+ 浓度降低。


    4、模板:就模板而言,影响PCR的主要指模板的数量和纯度。一般PCR反应中模板的数量为10 2 ~10 5 个拷贝,灵敏的PCR甚可从一个细胞、一根头发、一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板的纯度一般要求不是很高,某些扩增实验中甚将裂解液直接作为PCR模板。但模板中不能有影响扩增反应的物质存在,如蛋白酶、核酸酶、尿素、SDS、EDTA、卟啉类物质等,上述物质的存在会影响扩增效果,甚使扩增失败。模板DNA的量不能太高,否则扩增可能不会成功,在此情况下可适当稀释模板。一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说,100ul的反应体系中有100ng的模板已足够。


    5、Mg 2+ :Mg 2+ 浓度对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。一般PCR反应中,当dNTP浓度为200μM时,Mg 2+ 浓度为1.5~2.0mM为宜。Mg 2+ 浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,Mg 2+ 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。此外,Mg 2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。


PCR反应条件:
    1、变性温度与时间:变性温度低,解链不*是导致PCR失败的主要原因。一般情况下,93℃~94℃/min足以使模板DNA变性,若低于93℃则 需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物*变性,就会导致PCR失败。
    2、退火温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:

 

Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)
   复性温度=Tm值-(5~10℃)
   在Tm值允许范围内,选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60秒,足以使引物与模板之间*结合。
    3、延伸温度与时间:PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。
    4、循环次数:循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30~40T之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。

 

PCR纯化Kit订购说明:

1、绝大部分产品备有现货,一般情况下都能订货当日发货。 
2、部分非常用产品,需提前1-2日预订,海外期货则需要提前3-6周预订。 
3、部分产品价格会因货期、批次等因素发生变化,若有变动以订货当日新价格为准。 
4、每日订单截止时间为16点整,部分城市可到17点整,因超过截止时间造成当日不能发货的将于次日安排发货。
5、请办理完货款后,将收据、底单等连同收货人的地址、姓名、等以传真、、短信、等形式通知我们。


运输说明:

1、极低温产品:极低温产品运输过程中加装干冰运输。用干冰把产品包裹起来,再用泡沫盒密封,胶带层层粘住泡沫盒,放入索莱宝的箱子,然后交付给合作快递,安全快速高效放心的送客户的手中,保证产品的性质稳定如一,为您的实验保驾护航。
2、低温产品:低温产品运输过程中加装索莱宝冰袋运输。事先用冰袋把产品包裹起来,再使用泡沫盒密封,用胶带严实密封泡沫盒,再放入索莱宝的箱子(保温效果少可以持续一周),然后交付给合作快递,安全快速高效放心的送客户的手中,保证产品的性质稳定如一,为您的实验保驾护航。
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