脂肪酸合成酶（FAS）活性检测试剂盒说明书

微量

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0555

规格：100T/96S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂一：临用前取一支加入1 mL试剂三，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存2周，禁止反复冻融。

2. 试剂二：临用前取一支加入1 mL试剂三，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存2周，禁止反复冻融。

3. 试剂四：临用前取一支加入0.5 mL试剂三，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存2周，禁止反复冻融。

产品说明：

脂肪酸合成酶（Fatty acid synthetase，FAS）是一种关于脂肪酸再生能力并起重要作用的限速酶，它通过催化丙二酰辅*A、乙酰辅*A和NADPH生成长链脂肪酸和NADP+，NADPH在340nm条件下有特征吸收峰。通过检测340nm条件下吸光值的下降速率，可以计算出FAS活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、低温离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器/超声波细胞破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌、细胞样本的制备：按照细胞数量（10⁴个）: 提取液体积（mL）为500~1000 : 1的比例（建议500万细胞加入1 mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300W，超声3秒，间隔9秒，总时间5 min）；于4℃，

12000 g离心20 min，取上清液，置于冰上待测。

2、组织样本的制备：按照质量（g）: 提取液体积(mL)为1: 5~10的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1mL

提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，12000 g离心20 min，取上清液，置于冰上待测。

3、血清（浆）等液体样本：直接测定

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至340 nm，蒸馏水调零。

2、 试剂三临用前置于37℃保温15min。

3、 加样表（在96孔UV板或者微量石英比色皿中加入下列试剂）

三、FAS活性计算

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

（1）按照蛋白浓度计算

单位定义：在37℃条件下，每毫克蛋白每分钟氧化1 nmol NADPH为1个酶活单位。

FAS (U/mg prot) =[ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹] ÷(Cpr×V样)÷T=1607.7×ΔA÷Cpr

（2）按照样本质量计算

单位定义：在37℃条件下，每克组织每分钟氧化1 nmol NADPH为1个酶活单位。

FAS (U/g 质量) =[ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=1607.7×ΔA ÷W

（3）按细胞数量计算

单位定义：在37℃条件下，每10⁴个细胞每分钟氧化1 nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS (U/10⁴ cell) =[ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(N×V样÷V样总)÷T=1607.7×ΔA ÷N

（4）按液体体积计算

单位定义：在37℃条件下，每毫升样本每分钟氧化1 nmol NADPH为 1个酶活单位。

FAS (U/mL) =[ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷V样÷T=1607.7×ΔA

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20 μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；N：细胞数量，万个（以万计）；10⁹：换算系数，1mol=10⁹ nmol。

b.  使用96孔UV板测定的计算公式

（1）按照蛋白浓度计算

单位定义：在37℃条件下，每毫克蛋白每分钟氧化1 nmol NADPH为1个酶活单位。

FAS (U/mg prot) =[ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹] ÷(Cpr×V样)÷T=2679.5×ΔA÷Cpr

（2）按照样本质量计算

单位定义：在37℃条件下，每克组织每分钟氧化1 nmol NADPH为1个酶活单位。

FAS (U/g 质量) =[ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=2679.5×ΔA ÷W

（3）按细胞数量计算

单位定义：在37℃条件下，每10⁴个细胞每分钟氧化1 nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS (U/10⁴ cell) =[ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(N×V样÷V样总)÷T=2679.5×ΔA ÷N

（4）按液体体积计算

单位定义：在37℃条件下，每毫升样本每分钟氧化1 nmol NADPH为 1个酶活单位。

FAS (U/mL) =[ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷V样÷T=2679.5×ΔA

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板，0.6 cm；V反总：反应体系总体积，200 μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20 μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；N：细胞数量，万个（以万计）；10⁹：换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1、提取液中含有BSA（约2mg/mL），测定上清液蛋白浓度时需要减去提取液中蛋白浓度。

2、如果测定吸光值＞1.5或ΔA＞0.5，建议用蒸馏水稀释样本后再进行测定，计算公式中乘稀释倍数。如果测定吸光值较小，建议加大样本量后再进行测定。

实验实例：

取0.1 g小鼠肝脏加入1 mL提取液进行冰浴匀浆。12000 g 4℃离心20 min，取上清置冰上，之后用石英微量比色皿按照测定步骤操作，测得计算ΔA =（A1测定-A2测定）-（A1空白-A2空白）= （1.1783-1.0945）-（0.5653-0.5593）=0.0778，按样本质量计算酶活得：

FAS(U/g 质量)  =1607.7×ΔA ÷W=1251 U/g质量。

参考文献：

[1] Robinson J D, Bradley R M, Brady R O. Biosynthesis of Fatty Acids[J]. Journal of Biological Chemistry, 1960, 238(2).

[2] Tcl B. Purification and crystallization of rat liver fatty acid synthetase[J]. Archives of Biochemistry & Biophysics, 1981, 209(2):613-619.

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