吡咯啉-５-羧酸合成酶活性检测试剂盒 其它

1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

货号: BC4420

规格: 50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、试剂三：临用前加入2.5 mL蒸馏水溶解，现配现用，-20℃分装保存，-20℃保存一周；

2、试剂四：临用前每瓶加入3 mL蒸馏水溶解，现配现用，-20℃分装保存，-20℃保存一周。

产品说明：

在干旱、盐渍化、重金属、紫外线等不同的胁迫条件下，均会诱导植物体内脯*酸的积累，对植物起到保护作用。高等植物中，脯*酸的合成有两条途径，分别以谷*酸和鸟*酸为前体。谷*酸途径主要负责胁迫条件下脯*酸的积累，而鸟*酸途径主要在氮充足条件下起作用，与胁迫情况下脯*酸的积累没有关系。

1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯*酸的谷*酸合成途径中的关键酶，P5CS是一个双功能酶，在NADPH和ATP作用下，可催化谷*酸磷酸化及谷*酸 γ-半醛还原，通过测定NADPH在340 nm处吸光度的变化，可计算出P5CS的活性高低。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1 mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织样本：按质量（g）︰提取液体积（mL）1︰5~10比例（建议称取0.1 g样本，加入1.0 mL提取液一）加入提取液一，再加入10 μL提取液二，冰浴匀浆后于4℃，8000 rpm，离心15 min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30 min以上，调节波长至340 nm，蒸馏水调零。  

2、 将试剂三、试剂四置于冰上待测。

3、 操作表：（在1 mL石英比色皿中操作）

注意：空白管只需测定1-2次。

三、P5CS酶活计算

1、按样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol NADPH为一个酶活单位。

P5CS酶活（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反总×10⁹÷(V样×Cpr)÷T =321.54×ΔA÷Cpr

2、按样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol NADPH为一个酶活单位。

P5CS酶活（U/g 质量）= ΔA÷ε÷d×V反总×10⁹÷(W×V样÷V样总)÷T =324.76×ΔA÷W

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，0.001L；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.1 mL；V样总：加入提取液体积，1.01 mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5 min；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1、当A1测定高于1.2或者ΔA大于0.5时，建议将样本稀释后检测，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2、尽量使用新鲜样本进行检测，操作时请置于冰上操作。

3、ΔA空白管的数值一般不超过0.05。

实验实例：

1、取0.1g三叶草进行样本处理，样本稀释2倍，按照测定步骤操作，计算得ΔA测定管= A1测定-A2测定=0.923-0.895=0.028，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.667-0.659=0.008，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.02，按照样本质量计算酶活得：

P5CS酶活（U/g 质量）=324.76×ΔA÷W×稀释倍数=129.9 U/g 质量。

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