葡萄糖含量检测试剂盒 糖代谢

葡萄糖含量检测试剂盒(邻甲苯胺显色法)说明书

可见分光光度法

货号：BC5870

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：取9mL试剂二、45mL冰乙酸加入试剂一混合，最后工作液为均一澄清液体。溶解好的试剂-20℃分装避光可以保存8周。（注：若先将试剂一、试剂二混合，则溶液为无机相和水相的液体混合物，加入冰乙酸混匀后溶液会变均一澄清）

2、 标准品：临用前加入1 mL 蒸馏水充分溶解，制备 10 mg/mL 葡萄糖标准溶液待用；用不完的试剂2-8℃保存4周。临用前取30μL10mg/mL葡萄糖标准溶液，加入930μL蒸馏水，配制成0.3125mg/mL葡萄糖标准溶液。

产品说明：

葡萄糖不仅是细胞能量代谢的主要底物，而且其代谢中间产物是生物合成的重要底物。就哺乳动物而言，葡萄糖不仅是大脑神经系统、肌肉、脂肪组织等的唯*能源，而且与还原性辅酶、乳糖和乳脂的合成密切相关。

葡萄糖与邻甲苯胺在强酸溶液中加热，葡萄糖的醛基与邻甲苯胺缩合成葡萄糖基胺，后者脱水生成席夫（Schiff）碱，呈现蓝绿色，在630nm处有吸收峰。该试剂盒适合测定动物组织、血清（浆）及细胞（细菌）样本。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、分析天平、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、可调式移液枪、冰乙酸（AR＞98%）、5%三氯*酸（根据注意事项确定是否需要自备）、异丙醇（根据注意事项确定是否需要自备）、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 血清（浆）等液体样本：直接测定。若液体有浑浊则离心取上清测定。

2. 细胞/细菌：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），超声波破碎细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3. 动物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。  

二、测定步骤

1．可见分光光度计预热30min以上，调节波长至630nm，冰乙酸调零。

2．操作表：（在1.5mL EP管中加入下列试剂）

三、葡萄糖含量计算

1. 按样本质量计算

葡萄糖含量（mg/mL）= ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V提÷W = 0.3125×ΔA测定÷ΔA标准÷W

2. 按样本蛋白浓度计算

葡萄糖含量（mg/mg prot）= ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V样÷(V样×Cpr) =0.3125×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

3. 按液体体积计算

葡萄糖含量（mg/mL）= ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V样÷V样= 0.3125×ΔA测定÷ΔA标准

4. 按细胞数量计算

葡萄糖含量（mg/10⁴ cell）= ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V提÷N= 0.3125×ΔA测定÷ΔA标准÷N

C标：标准管浓度，0.3125mg/mL；V提：前处理提取液体积，1mL；V样：加入样本体积，0.1mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；N：细胞数量，以万计。

注意事项：

1、 试剂一具有腐蚀性，请佩戴好手套口罩，小心操作。

2、 高血脂样本若最终反应液出现浑浊，在反应液中加入550μL的异丙醇，充分混合，可以溶解脂质，消除浑浊，测定其吸光值。计算时将所测得吸光度乘以1.5。

3、 严重黄疸、溶血等血清样本，需要先制备无蛋白血滤液（建议100μL样本加300μL 5%三*酸溶液，充分混合，相当于将样本稀释四倍，3000rpm 4℃离心10min，取上清待测），再进行计算。注意同步修改计算公式。

实验实例：

1. 取100μL人血清样本，用蒸馏水稀释5倍，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A测定-A空白=0.277-0=0.277，ΔA标准=A标准-A空白=0.472-0=0.472，按液体体积计算得：

葡萄糖含量（mg/mL）=0.3125×ΔA测定÷ΔA标准×5 =0.917 mg/mL。

2. 取0.1g小鼠肌肉组织，按前处理和测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A测定-A空白=0.098-0=0.098，ΔA标准=A标准-A空白=0.472-0=0.472，按液体体积计算得：

葡萄糖含量（mg/mL）=0.3125×ΔA测定÷ΔA标准÷W =0.659 mg/mL。

参考文献：

[1] Yee H Y, Goodwin J F. Evaluation of some factors influencing the o-toluidine reaction with glucose[J]. Analytical Chemistry, 2002, 45(13).DOI:10.1021/ac60335a030.

[2] Dubowski K M. An o-Toluidine Method for Body-Fluid Glucose Determination[J]. Clinical Chemistry, 1962(6) :6.DOI:10.1093/clinchem/8.6.592.

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