线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性测试盒

线粒体呼吸链复合体Ⅰ/NADH-CoQ还原酶活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0510
规格：50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：试剂放于瓶内玻璃管内，临用前取一瓶加入2 mL丙 酮，充分溶解，2-8℃可分装保存1个月；

2. 试剂三：临用前加入0.1mL丙 酮，丙 酮 易挥发，使用完毕后注意封口，-20℃可保存2个月；

3. 试剂三工作液：临用前根据用量将试剂三：丙 酮=10μL：1mL（约20T）混合备用，现用现配；

4. 试剂四：临用前取一瓶加入2.4mL蒸馏水（约30T），现用现配，充分溶解，-20℃可保存1个月，避免反复冻融；

5. 工作液的配制：根据用量将丙 酮：试剂二：试剂三工作液=250μL：250μL：500μL（约10T）混合备用，现配现用。

产品说明：
复合体Ⅰ（EC 1.6.5.3）又称NADH-CoQ还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ，同时可使O₂还原生成O^2-，是呼吸电子传递链上产生O^2-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。
复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成NAD⁺，在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。


注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、细胞超声破碎仪、丙 酮、冰和蒸馏水。
操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL提取液一，用匀浆器或研钵于冰上快速匀浆（约30次）。

2. 4℃ 600 g离心10min，弃沉淀，留上清。上清再次离心，4 ℃ 11000 g离心15min，得到上清液和沉淀。

3. 上一步结果得到的上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4. 在沉淀中加入200μL提取液一和200μL 提取液二，超声波破碎（功率200W，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于复合体Ⅰ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计预热30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一37℃预热15min。

3. 操作表：在1mL石英比色皿中分别加入

三、复合体Ⅰ活力单位的计算
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T =3215.43×ΔA÷Cpr
V反总：反应体系总体积，10^-3L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（A1高于1.5），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数）；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。

2. 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量（约0.5mg/mL）。

3. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活。另附按样本计算公式和按细胞数量计算公式

4. 附：使用样本重量计算公式：（样本检测数为50T/24S） 

A、上清中复合体I活力的计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体I活性（U/g质量）= [ΔA1×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样)÷T=3215.43×ΔA1÷W
ΔA1：上清测定值；V反总：反应体系总体积，10^-3L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：
比色皿光径，1cm；V提取：加入提取液一体积，1mL；V样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，1min；W：样本质量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
B、沉淀中复合体I活力的计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体I活性（U/g质量）= [ΔA2×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样)÷T=1286.17×ΔA2÷W
ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，10^-3L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V提取：沉淀重悬体积（0.2mL提取液一+0.2mL提取液二），0.4mL；V样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，1min；W：样本质量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
C、样本复合体I总活力的计算：
样本复合体I总活力即为上清中复合体I活力与沉淀中复合体I活力之和。
按样本质量计算：复合体I（U/g 质量）=3215.43×ΔA1÷W+1286.17×ΔA2÷W

1. 附：使用细胞数量计算公式：（样本检测数为50T/24S） 

1. 上清中复合体I活力的计算：

单位的定义：每10⁶个细胞在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体I活性（U/10⁶ cell）= [ΔA1×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V提取×V样)÷T =3215.43×ΔA1÷N
ΔA1：上清测定值；V反总：反应体系总体积，10^-3L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V提取：加入提取液一体积，1mL；V样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，1min；N：细胞数量，以10⁶计；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

1. 沉淀中复合体I活力的计算:

单位的定义：每10⁶个细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体I活性（U/10⁶ cell）= [ΔA2×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V提取×V样)÷T=1286.17×ΔA2÷W
ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，10^-3L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm d：比色皿光径，1cm；V提取：沉淀重悬体积（0.2mL提取液一+0.2mL提取液二），0.4mL；V样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，1min；N：细胞数量，以10⁶计；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

1. 样本复合体I总活力的计算：

样本复合体I总活力即为上清中复合体I活力与沉淀中复合体I活力之和。
复合体I总活性（U/10⁶ cell）=3215.43×ΔA1÷N +1286.17×ΔA2÷N
相关发表文献：

1. Huazhang Zhu,Weizhen Zhang,Yingying Zhao,et al. GSK3β-mediated tau hyperphosphorylation triggers diabetic retinal neurodegeneration by disrupting synaptic and mitochondrial functions. Molecular Neurodegeneration. November 2018.

2. Liuqin He,Haiwen Zhang, Xihong Zhou. Weanling Offspring of Dams Maintained on Serine-Deficient Diet Are Vulnerable to Oxidative Stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. September 2018.

3. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018.

4. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

5. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury-induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

6. OuYang Q, Tao N, Zhang M. A damaged oxidative phosphorylation mechanism is involved in the antifungal activity of citral against Penicillium digitatum[J]. Frontiers in microbiology, 2018, 9: 239.

参考文献：

1. Gadicherla A K, Stowe D F, Antholine W E, et al. Damage to mitochondrial complex I during cardiac ischemia reperfusion injury is reduced indirectly by anti-anginal drug ranolazine[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2012, 1817(3): 419-429.

2. Eike L, Jakob M C, Julian D L, et al. Conformational changes in mitochondrial complex I from the thermophilic eukaryote Chaetomium thermophilum [J]. Science Advances, 2022, 8(47): 419-429.

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