Cesium chloride

Cesium chloride

Cesium chloride相关实验：

密度梯度离心基础

一、概论
在密度梯度离心中，单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。梯度液的密度随着离心半径的增大而增加。密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，密度梯度可以分为：速率—区带（Rate-Zonal）离心和等密度（Isopycnic）离心。
在速率—区带离心中混合样品以很薄的一层铺在梯度液的上部，在离心过程中由于不同组份“颗粒”在梯度液中沉降速率的差别，而在离心的某一时刻形成了数个含有单一组份颗粒的“区带”。离心过程中在“重”的样品（或者说沉降得快的样品）形成沉淀前就停止了。样品在离心后与梯度液一起收集，用常规技术去除梯度材料后就得了某个较纯的成份。每个单一组份的沉降速率取决于它们的形状、尺寸、密度、离心力的大小、梯度液的密度和粘性系数。
对于相类似的生物体组份常常形状也相似。在速率—区带离心中我们常常使梯度液的大密度不超过在该梯度中的浮密度。利用这类生物体组份在尺寸上的差异而形成的沉降速率的不同，选择某一特定时刻，当它们中的各个纯样品区带之间的距离拉得远时停止离心即可以达到分离目的。
与速率—区带离心法不同的是，等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的。混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚和梯度液混在一起。后一种方法依靠离心力来形成梯度（自形成梯度）在形成梯度的过程中由于样品各单一成份向它们自己的等密度区靠拢即达到了分离纯化的目的。对于速率—区带离心，梯度液大密度一般小于样品中各组份的密度，也就是说是在样品正在沉降过程中的不是在形成沉淀后来分离样品；而等密度离心法中，梯度液的初始大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。
密度梯度离心法的理论基础是（参考文献 1）
每种纯样品成份在梯度液中的沉降速度可以表达为： 

式中：v是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒） 
         d：样品颗粒的直径（厘米），我们在初步计算时就假设样品颗粒为球体。非球形颗粒样品，可以以上式为基础进行修正。
         &;：样品颗粒的密度（克/厘米3）
         ρ：密度梯度液的密度（克/厘米3）
         η：密度梯度液的粘性系数（克/厘米•秒）
         ω：离心机主轴的旋转角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：转/分 
         r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）
当：&;>ρ时，v>0即样品顺离心力方向沉降 
      &;<ρ时，v<0即样品逆离心力方向上浮 
      &;=ρ时，v=0即样品停止沉降或上浮，“稳定”在这一位置
用这个公式可以很好地解释在速率—区带离心法或等密度离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。

二、转头的选择：

1、离心转头分类：

其他特种转头：分析转头、土壤脱水转头、细胞浮选转头、管式转头、血球比测定转头、细胞淘洗转头等等。

 2、各种转头用于密度梯度离心的比较：
（1）各种转头用于速率—区带（R-Z）离心的优缺点分析： 
A、固定角式转头：壁部效应影响很大，用于 R-Z离心回收率低，纯度也受影响一般只用于差分离心和等密度离心，离心时间较短。是各类离心机的高速转头。 
B、甩平转头：细长离心管用于 R-Z离心可以获得较高纯度和高分辨率，且容易控制离心时间，壁部效应很小。25,000rpm~30,000rpm的甩平转头适用于亚细胞器的离心分离，而 40,000~42,000rpm的甩平转头适用于核酸、蛋白、病毒等类物质的分离。离心时间较长。 
C、垂直管转头：沉降距离短，因而离心分离时间也短。大半径前几乎没有壁部放位，大半径后有一定壁部效位，垂直剖面积较大，因而离心后纯样品区带的容量也较大。但在有沉淀的密度梯度离心中，沉淀和浮动区带方向转换之间存在干扰，可能影响纯样品区带的纯度。大部分 R-Z离心没有沉淀，垂直管转头很适合做R-Z离心。 
D、近垂直转头：管轴线与旋转主轴之间倾角7度~9度（角式转头20度~45度）沉降距离比垂直转头稍大，离心时间比角式、甩平转头都要短。由于有了倾角，沉淀可沿管壁滑向底部，因此基本上消除了沉淀与浮动区带转换之间的干扰，适合做R-Z离心，特别适合做生物大分子（如质粒DNA）的自形成梯度等密度离心。 
E、区带转头：没有壁部效应特别适合做大容量的病毒、亚细胞器、生物大分子的R-Z离心，可用于研究、中试和小批量生产。分离纯度高，量大，但操作要求高，转头及附件价格昂贵。 
F、连续流离心转头：工作原理与区带转头相似，可连续工作，分离量大，分离纯度高，可用于各种生物体的差分、R-Z及等密度离心。近年来高速连续流转头常用于大量发酵液（大肠杆菌、细胞）菌体的沉淀。

（2）各种转头用于等密度离心的优缺点分析： 
A、固定角式转头：主要用于差分离心的角式转头，在超速离心机上可以很好地用于等密度离心，尤其是 DNA平衡等密度离心，自形成梯度，用快速密封管或厚壁管，常用的单管的容量为 10~40ml。常用转速 40,000~80,000rpm，离心时间较短，分离纯度也较高。 
B、甩平转头：用作等密度离心时，壁部效应对分离效果影响较小，梯度变换在甩平时自然过渡因而很适合做等密度离心实验，优点是回收率高，分辨能力强。缺点是沉降距离长，高转速较低（由于结构原因此类转头高转速一般在 60,000rpm以上）因而，离心时间很长，对某些长离心管，10~15ml容量的转头高速在 40,000~41,000rpm，用作自行成 CSCL梯度的质粒 DNA离心往往需要 50~70小时。 
C、垂直管转头：适合作等密度离心，沉降距离短，在没有沉淀或沉淀非常坚实的情况下，对于现代可自由选择加速、减速时间的离心机，梯度转换得很好。这类转头转速很高（目前高转速可达 100,000rpm，700,000×g）离心时间短，分离纯度高，样品容量较大（垂直剖面积大）。
D、近垂直转头：九十年代开始使用的新型转头，用作生物大分子（ DNA，RNA，蛋白质等）的平衡等密度离心佳，目前这类转头的高转速已达 100,000rpm近750,000×g），离心时间比垂直转头稍长。 
E、区带转头：非常适合做大容量样品的等密度离心。 
F、连续流离心转头：高、低速连续流转头一般不用作密度梯度离心，超速连续流转头适合做大容量样品的等密度离心分离。

三、密度梯度——材料和梯度型式的选用 
1、对于速率-区带密度梯度离心，梯度选择要点
（1）概述：用速率-区带法（Rate-Zonal，简称R-Z法）进行分离的主要原理是依靠不同样品在梯度中沉降速率的不同来分离纯化样品，因此希望样品沉降能通过整个离心管长度来提高分辨率。作为基本条件就是梯度液的大密度必须小于样品颗粒的密度。
用有密度梯度的支持液作R-Z离心有以下优点：
●当样品中不同组份分层进入梯度液时，梯度的较高密度支持着样品，这样就使混合样品中各个不同密度的层次以较窄（或较薄）的区带沉降从而得到较高的分辨率（或较高的纯度）。
●梯度液的密度一般是从离心管上部到底部逐渐增加，这样就可以稳定液柱，提高抗对流和抗机械扰动的能力（接近离心过程结束时，纯样品区带和它的支持液的密度差较小）。
●梯度液粘性系数逐渐增大也使纯样品区带变窄从而提示了分辨率。而逐渐减缓的沉降速度使同一组份样品逐渐靠拢，提高了分离纯度。

（2）梯度材料的选用
        一个理想的梯度液应具备：化学稳定性好；高溶解度；低渗透性；在溶剂中的稳定性；较低的光吸收特性；低廉等。遗憾的是很难找到一种适合于各种 R-Z离心的*无缺的梯度液。
对于大多数R-Z离心，蔗糖是比较合适的梯度材料。尽管它在高密度（40~60% W/ W）时粘性系数较大，但综合比较表明它可以广泛应用。但由于蔗糖在各种密度时（即使是低密度时也如此）有较高的渗透性，分离一些对渗透性敏感的生物体组份时需要选择其他梯度材料，如由 公司开发的 Ficoll等等。
      在大多数情况下，梯度液的 PH值应与被分离时生物制品的生理 PH值*。
      对密度梯度材料的基本要求：
（a）能够配制所需要的密度范围
（b）粘性系数较低
（c）溶解度高
（d）有密度与光折射率的对照资料
（e）对被分离样品无损害
（f）对被分离样品渗透很少
（g）在离心分离完成后很容易与生物样品分离
（h）化学性能稳定
（i）对离心过程中所接触的转头材料，离心管，管盖及密封件，连续流及区带转头的管道等等无腐蚀作用。
（j）纯度高
（k）毒性少
（l）价格较低
（m）已知该材料的某些物理、化学、热力学性能。

常用的梯度材料有：蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、酒石酸钾、溴化钾、碘化钾、氯化铯、氯化铷、三氯醋铯、三氟醋酸铯、右旋糖苷、白蛋白、 Ficoll、Percoll、Metrizamide、 Nycodenz、Ludox、Dextran等等。 
（3）梯度形状的选择
        所谓梯度形状是指梯度介质沿着离心管长度方向的密度变化特征。用于 R-Z离心密度梯度常用连续梯度也就是密度随着离心半径的增加而光滑地（不是突变地）增大，直线型的，光滑曲线型的（一般用凸指数或凹指数曲线，或凸凹指数曲线联用的）都属于连续梯度。不连续（阶梯型）梯度多用于等密度离心。
●线性梯度：
在甩平转头中做 R-Z离心常用线性梯度。
制备线性梯度时要注意：
在甩平或垂直转头中制备线性梯度时，梯度液面的密度必须足以支持样品，而底部密度必须小于被分离样品各个组份的密度。
一般地说较大的梯度斜率可以得到较高分辨率。
蔗糖的常用线性梯度范围是 5~20%W/V或 10~40%W/V。
可以用梯度仪制备线性梯度，也可以人工铺设数个阶梯型梯度，离心管静置一段时间后也可以形成近线性梯度。
●等运动梯度（等速梯度）（Isokinetic）
等运动梯度是指在某一恒定离心转速时，样品颗粒在梯度中以定常速度沉降。要做到等速沉降，必须使梯度液密度和粘性力的增加与沿着离心半径方向的离心力增加相平衡，在这种梯度液中，颗粒的沉降距离与离心时间，离心力，以及颗粒本身的沉降系数成正比。因此如果已知某单一组份样品的沉降系数，就可以算出在同一梯度中沉降的其他组份的沉降系数。
在甩平转头中用等速沉降梯度时，从旋转中心算起的离心距离与沉降系数的关系应该是线性关系。为了构造等速沉降梯度我们必须注意到转头、离心管，梯度介质的密度、浓度和粘性系数在同一温度。
在甩平转头中作蛋白质分离常用 5~20%（W/V）蔗糖梯度在 5℃离心可以达到近似的等速沉降的效果，而 10~30%（W/V）的甘油梯度在 5℃时 DNA或 RNA也可以达到近似等速沉降的目的，其他大多数样品分离的等速沉降梯度是凸指数型曲线。
●凸型指数曲线与凹型指数曲线梯度：
为了支持样品使其中组份在离心开始前不致于沉入梯度，我们常希望梯度曲线在近液面处有较陡的斜率，也就是说在近液面处梯度液的密度沿离心管长度方向增加得很快。这就是凸指数曲线梯度，与此相反，如果液面处梯度液足以支持（托住）样品，故考虑到某些样品在离心管中下部需要较慢的沉降率（在高密度区）才能得到理想的分辨率，那么凹型指数曲线型梯度便能满足这个要求。
●复合型梯度：
如果用程序梯度仪来准备梯度，那么上节中的凸凹指数曲线梯度可以复合在同一梯度液中，这样的复合梯度在它们各自的区域保持了它们各自的优点。当然也可以制备其他类型的复合梯度。一般说，复合梯度多用于区带离心。 

2、等密度离心，梯度要素的选择
（1）梯度材料及梯度溶液选择
所有的等密度离心都使用水溶性缓冲剂作溶剂，缓冲剂的组成及 PH值取决于生物样品的性质。对细胞、亚细胞结构或其他生物大分子的等密度离心分离各有不同要求。
常用于等密度离心梯度材料有：

从上表可以看出，对 R-Z离心，蔗糖是很好的梯度材料，而对于等密度离心，不同的生物样品对梯度材料的要求有较大差异。
（2）梯度型式选择
离心时，溶液中的各组组份都同时处在离心场中，被分离的组份及梯度材料的分子都在离心力作用下向离心管底部（甩平、角式）或外壁（垂直管、近垂直管、区带转头、连续流转头）沉降。对于梯度材料，如果它们的沉降速度在离心初始阶段远大于浓度扩散速度，那么就可以形成连续的密度梯度。这就是“自形成梯度”产生的基本原理。我们可以把被分离样品和梯度材料混合在一起离心，梯度材料在离心过程中形成密度梯度，而样品中不同组份则沉降（或上浮）到它们自己的等密度区。
另一种方法是预先制备好密度梯度，将样品铺在离心管（或区带转头）的某一部份（如离心管上部、下部或中部）离心，使样品中各种组份沉降（或上浮）到它们自己的等密度区前后，从而达到了我们所需要的“平衡”结果。
预先形成梯度可以是不连续的（阶梯型），也可以是连续梯度。阶梯型不连续梯度大多适用于从植物或动物组织的匀浆中分离整细胞或亚细胞器，或用于某些病毒的纯化。而连续梯度由于其密度平滑地变化，对于某些生物样品的多种成份组合的分离可以得到较高的分辨率因而得到了广泛的应用。
选择自形成梯度还是预形成梯度，主要取决于材料的性质。某些胶体硅材料可在10,000~20,000×g的离心场中离心30分钟就可以自形成梯度（例如美国 Dupont公司的 Ludox及瑞典 pharmarcia公司的 Percoll）。但对某一些材料，自形成梯度的时间很长，对离心力的要求也很高。CSCL或 Metrizamide需要在50,000~500,000×g的离心场中离心数小时甚数十小时才能自形成梯度（如用CSCL做质粒 DNA分离，梯度液中加 E.B.和 Triton x-100，在 490,000×g需要离心4小时，才能利用CSCL的自形成梯度分离出质粒DNA，染色体DNA，RNA和蛋白质。）
预形成梯度的主要优点是离心时间较短，因为我们只要考虑样品中某个组份到达其等密。
预形成梯度的缺点是：
●被分离样品的容量较少（与自形成梯度相比）
●对某些样品如细胞或病毒会因单向沉降而产生颗粒聚结从而减少了样品回手率甚影响纯度。
●预先制备梯度液需较长时间，亦较繁复。
与预形成梯度相比较，自形成梯度有较大样品容积（特别是使用垂直剖面积较大的垂直管或近垂直离心这个优点更突出）；可以简单地调整初始密度；离心过程中样品既有上浮又有沉降，也就是混在梯度液中的样品在离心过程中，在梯度材料自形成梯度的同时从离心力的正反二个方向向自己的等密度区靠拢，后排列在自己的等密度区上下形成纯样品区带。从这个意义上说，样品是真正到达了自己的等密度取而具有很高的浓度。
自形成梯度的等密度离心又称平衡等密度离心（Eguilibrium-Isopycnic）
（3）自形成梯度
综上所述，某些梯度材料能够在离心过程中形成密度梯度， Ludox，Percoll中的胶体硅颗粒可以较快地向离心管管底（如甩平转头等）或外侧（垂直管转头）沉降而另一些材料如 CSCL，CS2SO4，Metrizamide等则在沉降过程中受到其反向浓度扩散的影响，达到平衡的时间就特别长。平衡后梯度曲线的形状不仅依赖于梯度材料本身，也取决于其他一些离心条件。自形成梯度的基本条件是样品中需要分离的各种组份在分离后都就包含在梯度范围中。佳的自行梯度形状还应该使被分离组份都处在各自的较窄的纯样品区带内，只有这样才能得到较高的分辨率。使很多单一组份在尺寸和密度上都有差异，这就使得同种样品区带离心后显得比较宽。为了提高分辨率就必须使梯度曲线变得陡一些，但要随心所欲做到这一点却很困难。
幸运的是对于所有梯度材料，计算自形成梯度的公式（也就是自形成梯度曲线的形成原理）是一样的。由于 CSCL分离质粒DNA已有近 30年的历史，大多数定量分析工作集中于讨论CSCL梯度。用下面的一些公式可以计算自形成梯度曲线的形状，可用于设计合适的密度梯度。
●梯度曲线的斜率：
密度梯度曲线中某一点的昀终斜率可以用dρ/dr下式计算： 

其中：ω是弧度（弧度/秒） 
         r：从旋转中心到计算点的距离（cm）
         β°：梯度材料的密度梯度比例常数。
β°的数值请参考：
（1）余兴明“质粒 DNA的超速离心分离”或
（2）J.B.Martin “Biopolymers”9，1970，P597 

用这个公式计算梯度曲线的中下部占3/4离心管中梯度高度的dρ/dr值比较接近实际情况，对
上部1/4长度与实际情况有些差别。
从上面公式可以看出，要使曲线变陡： 
a：降低β° 
b：提高转速 
c：加大离心半径 
d：增大初始密度
以同等转速离心，甩平转头的 r较大，在同等初始密度条件下，甩平转头的密度梯度曲线比垂直管转头、近垂直转头或固定角式转头都要陡一些。（参见下图）

CSCL初始密度为 1.72g/cm3时的自形成梯度曲线

九十年代以前生物大分子离心分离实验多数是利用甩平转头，转速在60,000rpm以下，某些实验一次要离心数十小时，使用的CSCL也较多（分析纯，价格高，且不能反复使用）离心分离成本昂贵（如80年代初期，质粒DNA分离，CSCL初使密度为1.71g/cm3，33,000rpm， 20℃甩平转头离心72小时，一次离心就用去了驱动部1.4亿转的寿命，而当时的超速离心机驱动部的保用寿命才100亿转，虽然由于CSCL在离心后梯度曲线较陡而获得了很纯的质粒 DNA和染色体 DNA，但成本实在是太高了）。九十年代开始使用近垂直管（或称小角度）转头，在 CSCL梯度中加入 E.B.和 Triton x-100，初始密度 1.55g/cm3、78,000rpm，20℃离心4小时（用去驱动部寿命0.187亿转）或用垂直管转头，同样的梯度 100,000rpm，20℃2小时（用去驱动部寿命0.12亿转都获得了满意的结果。（文献 5）
●梯度的密度范围：
在不同距离处（r2，r1）密度差可以用下面公式表示： 

从上式可以看出（ρ2-ρ1）值不仅和转速的平方而且和距离的平方差成正比。
●转头选择对梯度曲线斜率与梯度范围时影响：从前面的曲线图可以看出对不同转头，梯度曲线的差异：水平转头离心时和复原（离心完成）后对于梯度来说，离心管中液面管底距离保持不变。对固定角式，小角度转头及垂直管转头，离心头沉降距离很短，而在离心后复原时这项距离明显拉长了，也就是说梯度曲线变得平缓了，这种距离的延伸有利于离心分辨率的提高。因此垂直管转头比NVT（近垂直管）转头，NVT转头比角式转头的距离延伸更大，分辨率也就更高。但与此相反，纯样品带的宽度都是甩平转头窄，垂直管转头宽。
●梯度中的大和小密度：
计算前，首先要找到等密度点的位置。
等密度点：离心后密度与离心开始时初始密度相等的点。
对于甩平转头：设等密度点为 rc 

式中：rt梯度表面与旋转中心距离 
         rb离心管底与旋转中心距离
该公式可用于估算离心结束时（转头刚开始减速时）角式转头及垂直管转头的 rc位置。设梯度液初始密度（均匀）为ρ i，在求得 rc后梯度中大密度与小密度可用下式计算：

如果已经设计好密度变化范围就可以计算所需要的离心转速：

●计算实例： 
DNA分离，CSCL梯度，初始密度 1.70g/cm3，根据离心要求，理想的大密度为ρb=1.75g/cm3，小密度为ρt=1.65g/cm3
用某甩平转头高转速55,000rpm，rb=12cm，rt=6.7cm则 N=45,500rpm，
校核：由于密度＞1.2 g/cm3按规定这个转头的高转速不能超过： 

46,200rpm＞45,500rpm所以设计成立。
●离心时间计算：
计算例题中离心所需要的时间：
已知 r平均=9.35cm，样品 S20.w=15 

●讨论必须注意不能使 CSCL在离心管底部大密度超过 1.9 g/cm3， 20℃，否则CSCL将可能析出结晶，而CSCL的结晶密度为4 g/cm3，很可能在结晶的局部损坏塑料离心管，从而造成CSCL泄漏而进一步腐蚀转头，（特别是铝合金转头）而造成转头在离心中炸裂的严重事故。为安全起见，重金属的梯度实验不要在铝合金转头或甩平转头中的铝合金吊桶中做。
（4）预形成梯度
●不连续（阶梯型）梯度：
分层铺设不连续梯度，样品铺在梯度液之上，离心时不同组份越过小于本身浮密度时梯度层次而后到达密度大于样品浮密度的梯度界面之前形成纯样品区带。一般设置三五个层次。
●连续梯度：
根据被分离样品的性质设计线性、凸指数、凹指数或凹凸复合指数曲线梯度。样品一般铺在梯度液上部离心分离，要注意的是某些梯度材料（如重金属盐）预形成梯度在离心过程中由于离心力和浓度扩散的复合作用而可能改变形状。我们也可以用离心来制备预形成梯度，如果形成的梯度曲线（近直线型）中点的密度和初始密度相同则梯度的稳定时间（对 CSCL）
T=0.3 (rb −rt )2 （小时）
当然这是用于估计形成不同 CSCL梯度曲线所需要的时间的经验公式。它可用以实际离心操作。
（5）为了使实验人员对不同生物体在不同梯度材料中的浮密度有初步认识，下列图供参考图中：
a.在水或在 0.25M蔗糖液中的推定浮密度 
b.在等密度蔗糖液中推定浮密度 
c.在等密度 CS2SO4中推定浮密度 
d.在等密度 CSCL中推定浮密度

序数符号表示为： ①细胞核 ②质膜 ③细胞质 ④细胞核 ⑤线粒体 ⑥溶酶体 ⑦线粒体 ⑧溶酶体 ⑨内质纲 ⑩病毒
(1)细胞核 (2)质膜 (3)细胞质 (4)细胞核 (5)线粒体 (6)溶酶体 (7)线粒体 (8)溶酶体 (9)内质网(10）病毒 (11)核蛋白体 (12)核糖体 (13)DNA (14)糖原 (15)核糖体 (16)DNA (17)RNA (18)RNA (19)RNA

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