（胺盐） 三盐酸精脒

（胺盐） 三盐酸精脒

（胺盐） 三盐酸精脒相关实验：

一氧化氮(nitricoxide，NO)是生物体内发挥重要生理功能的气体小分子。

1998年， 美国药理学家RobertF.Furchgott、LouisJ.Ignarro及FeridMurad因揭示了NO在心血管系统中的信号分子作用而获得诺贝尔生理学和医学奖[1]，这将人们对NO的相关研究推向了新的高潮。在生物体内，NO通过一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)利用L-精氨酸(L-Arg)和分子氧作为底物，在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷(nicotinamideadeninedinucleotide2'-phosphate，NADPH)辅酶作为辅助因子提供电子的条件下，由黄素腺嘌呤二核(flavinadeninedinucleotide，FAD)、黄素单核苷酸(flavinmononucleotide，FMN)、四氢叶酸(tetrahydrofolate,THF)传递电子，催化L-Arg的两个等价胍基氮之一经氧化反应生成NO和L-瓜氨酸(L-citrullin)[2](图1)。

NOS有三种同工酶，包括：主要存在于神经系统中的神经型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS，是先被发现的NOS，故又称NOS-Ⅰ)，存在于巨噬细胞、肝细胞、神经胶质细胞中的可诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS，又称NOS-Ⅱ)，以及主要存在于血管内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS，又称NOS-Ⅲ)[3,4]。其中，nNOS和eNOS均为构成型酶，统称为构成型一氧化氮合酶(constitutivenitricoxidesynthase，cNOS)在神经系统中，NO作为一种重要的信使分子，参与了学习与记忆等重要的神经生理活动，同时对脑部血流具有调节作用，并参与神经系统的免疫防御[5～8]。

而另一方面，过量的NO又与脑缺血损伤、早老性痴呆及帕金森氏症等神经系统疾病的发生、发展有着密切的关系[9,10]。因此，在正常生理条件下，神经系统中存在着从时间和空间上调控NO产生、释放、扩散与灭活的机制，而这主要是通过调控nNOS的活化与去活化实现的。nNOS除了在神经系统中具有重要功能外，在骨骼肌、心肌和平滑肌当中也有表达分布，在这些组织中，NO对血流调节和肌肉收缩都具有重要的调控作用[11～13]。 作为一种构成型一氧化氮合酶，nNOS的活性主要依赖于翻译后水平上钙离子(Ca2+)/钙调蛋白(calmodulin，CaM)的调控。随着研究的深入，越来越多的证据表明，生物体内的nNOS调控有着复杂的机制，其酶活性在多个水平上受到调节，包括二聚化、多位点的磷酸化与去磷酸化，以及蛋白质与蛋白质的相互作用等。本文将着重对nNOS活性的调控机制进行综述。 nNOS的二聚化 NOS的活性受到酶构型的影响，二聚化对于NOS三种同工酶的活性都是*的。每一种NOS同工酶都具有相同的催化中心结构：羧基端为还原酶区(reductasedomain，NOSred)，该区域与NADPH结合，还包含FAD和FMN的结合位点；氨基端为氧化酶区(oxygenasedomain，NOSox)，此区域与底物L-Arg结合，还包含一个四氢生物蝶呤(BH4)结合位点和一个细胞色素P-450样亚铁血红素辅基的活性位点。NADPH提供的电子通过FAD和FMN，由还原酶区向氧化酶区传递[14]。活化的nNOS为二聚体形式，两个单体的氧化酶区之间形成的扩大界面为BH4和L-Arg创造了高亲和力的结合位点[15,16]，从而促进电子的传递。一些nNOS的抑制剂，如7-硝基吲唑(7-NI)，可以降低BH4和L-Arg与nNOS的亲和力，从而抑制nNOS的活性[17]。对iNOS的研究发现，电子是由一个单体的还原酶区向另一个单体的氧化酶区传递的，这也可能是NOS在单体形式下不表现活性的原因[18]。

此外，稳定的二聚体形式的nNOS更不易被水解，一些nNOS的底物类似物，如N(G)-硝基-L-精氨酸，可以稳定nNOS的二聚化形式，使其不发生泛素化，同样，BH4和亚铁血红素的结合也会促使nNOS形成稳定的二聚体[19]。 nNOS的磷酸化调控 nNOS的活性受到多种激酶和磷脂酶的调控。蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)、钙调蛋白依赖激酶(CaMkinases，CaMk)Ⅰ和Ⅱ，以及蛋白激酶A（proteinkinaseA，PKA)，均可通过磷酸化修饰nNOS而调控其活性。nNOS有多个可发生磷酸化的位点，不同位点发生的磷酸化和去磷酸化，对nNOS的酶活性有不同的影响。CaMKⅠ磷酸化nNOS的Ser741残基，CaMKⅡ磷酸化Ser847残基，通过抑制与Ca2+/CaM的结合而降低nNOS的活性[20,21]。相反，蛋白磷酸酶1可以通过降低Ser847位的磷酸化水平使nNOS的活性升高[22]。发生在Ser1412残基的磷酸化可增加nNOS的活性，而该位点的去磷酸化则使nNOS的活性降低[23]。 蛋白质-蛋白质相互作用对nNOS活性的调控 近年来的研究发现，nNOS可以与多种蛋白发生相互作用，这些相互作用的发生可以影响nNOS在细胞中的定位或直接影响nNOS的活性。

nNOS基因的外显子2编码了一段特殊肽段—— —PDZ结构域(PSD-95/Dlg/ZO-1homologydomain)，该结构域不但参与nNOS的二聚化(活化)，由该结构域介导的蛋白质-蛋白质相互作用也是nNOS与其它蛋白互作的重要方式之一，与nNOS的空间定位及功能有着密切的关系。钙调蛋白 NOS的还原酶区和氧化酶区由CaM结合区连接起来，只有与CaM结合之后，NOS才具有催化活性。CaM作为分子开关，能够促进电子从NADPH转移到亚铁血红素活性中心的效率[24]。Ca2+/CaM不存在的条件下，电子由FAD向FMN传递的速度会降低[25]。iNOS的活性调控主要发生在基因转录水平上，即使在低Ca2+浓度的条件下，CaM与iNOS的结合也十分紧密，因此，iNOS的活性基本不受Ca2+浓度的影响。cNOS则不同，在静息态下，cNOS保持低活性，随着胞内Ca2+浓度的升高，CaM与cNOS结合而导致酶活性上升，而胞内Ca2+浓度降低时，CaM会从cNOS上脱离，使酶活性下调。可见，cNOS的活性受到胞内Ca2+浓度的调控[26,27]。研究表明，热休克蛋白90能够促进CaM与nNOS的结合，激活nNOS，进而上调NO的产生[28,29]。N-甲基-D-天冬氨酸受体 膜蛋白N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartatereceptor，NMDA-R)在nNOS的活性调控中起着重要作用。神经元中，nNOS的活化依赖于兴奋性氨基酸信号偶联的Ca2+内流信号。在突触后神经元中，谷氨酸等兴奋性氨基酸通过NMDA-R引发Ca2+内流，导致细胞内Ca2+浓度升高，Ca2+结合CaM后激活nNOS产生NO，因此，NMDA-R是神经系统中重要的nNOS活化因素之一[30]。此外，NMDA-R还可以通过其它方式调控nNOS的活性。一方面，NMDA-R可以通过CaMKⅡ和钙调神经磷酸酶(calcineurin)调节nNOS的磷

亚精胺对诱导ＤＮＡ凝聚行为的影响研究

利用原子显微镜技术（AFM）研究了亚精胺加入次数及不同培养培养时间对DNA凝聚行为的影响，研究表明，DNA的凝聚次数由亚精胺的加入次数跟时间决定，随着加入次数的增加，DNA凝聚减慢，凝聚体尺寸变大，随着培养时间的增加，DNA凝聚体减慢，凝聚体尺寸变大，随着时间的增加，DNA凝聚体变得越来越紧凑。

有哪些潜在原因可导致用T4 DNA连接酶连接后转化失败?

反应体系内无ATP或Mg2+可导致连接失败：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。

反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高都可导致连接失败：纯化DNA。 去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不*：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA：保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。连接末端为单碱基突出末端：使用高5μl高浓度连接酶16°C连接。插入片段和质粒没有磷酸化。注意：如果载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。

加入过多的连接混合物感受态细胞：50μl感受态细胞应加入1-5μl连接混合物。

插入片段太大，不能进行环化：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C连接。

连接酶失活：用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。

连接混合物含有PEG且连接反应：长时间地在含有PEG的条件下连接可导致转化效率降低，这可能是由于逐渐产生的大片段线性DNA抑制了转化效率。快速连接试剂盒（NEB# M2200）的buffer含有PEG。

电转化前没有提纯连接混合物：电转化必须去除buffer，否则盐会导致瞬间放电，击穿细胞。可用透析或柱纯化的方法纯化连接混合物。虽然快速连接试剂盒（NEB# M2200）buffer
中含有的PEG不会导致击穿细胞，但是会抑制电转化，所以必须去除，可用柱纯化方法去除PEG。   Q2：解决转化问题时，还有什么因素需要考虑？

感受态细胞出了问题：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。

细胞不是感受态：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。

大肠杆菌不能很好的接受重组蛋白：试用pMAL系统（NEB＃E8000S）表达MBP(麦芽糖结合蛋白)
融合蛋白，或者试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。  

连接的DNA片段含有反向重复的序列，不能用大肠杆菌筛选：如果可能去除重复序列，或试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。

插入序列来自哺乳动物、植物或者含有甲基化的胞嘧啶，会被很多大肠杆菌菌株降解：使用mcrA、mcrBC 和mrr缺失菌株。

重组子太大（>10,000 bp）不能进行化学转化：用电转化。  

Q3：内切酶酶切反应后，有什么因素可以导致T4 DNA连接酶连接和后续的转化失败？

内切酶酶切不充分：如果酶切位点位于PCR产物的末端，识别位点末端侧需要加少6个保护碱基。用对照底物检测内切酶的活性。

内切酶没有*失活：如果内切酶不能热失活，用酚/氯仿抽提纯化DNA。

内切酶的星号活性消化了载体或插入片段：跑胶检测DNA，如果存在多余的条带，减少内切酶使用量或减短反应时间。

DNA或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染，
破坏了DNA末端：酚/氯仿抽提纯化DNA。检查内切酶的质量检测资料和注意事项，如果连接QC不佳或外切酶活性高，减少内切酶量或縮短反应时间。

使用T4 DNA连接酶，需要设置什么对照来检测细胞和DNA。
注意：每个对照组都使用相同浓度的DNA，一般为0.1-1.0ng/转化。 

转化空载体（未切割的）感受态细胞，目的：检测感受态细胞的质量以及质粒的抗性。分别涂布于含有和不含有抗生素的平皿上。

转化线性化后的载体，目的：检测未切开质粒的量，克隆数应该小于步骤1的1％。

酶切再连接质粒，目的：检测连接酶的活性以及DNA末端的完整性。克隆数应该与步骤1相近。

酶切后去磷酸化再连接质粒，目的：检测未*去磷酸化的背景。克隆数应该小于步骤1
的1％。  

Q5：什么情况下选用T4 DNA连接酶？

T4 DNA连接酶应该被用来连接粘性末端（室温10分钟）或平末端（室温2小时），或者连接反应需要。如果需要热失活连接酶，选用用T4 DNA连接酶。高浓度T4 DNA连接酶被用来连接单碱基突出末端，或连接需要长时间孵育来环化的大片段，比如BAC（细菌人造染色体）结构。  

T4 DNA连接酶能与快速连接buffer兼用吗？

可以，高浓度T4 DNA连接酶可以直接取代，如果是普通浓度的T4 DNA连接酶，将孵育时间从5分钟延长到15分钟。不要进行热失活，因为加热会让buffer内的PEG抑制转化。反应时间延长也会降低转化效率。  

T4 DNA连接酶连接应该加多少DNA？

单位定义用的是0.12 μM (300 μg/ml) lambda HindIII。高浓度的DNA用于linker的连接。为了促进环化（有利于转化），应该控制总DNA浓度于较低水平。载体＋片段总浓度应为：1-10 μg/ml。插入片段和载体的摩尔浓度比介于2-6之间，比例低于2:1会降低连接效率，高于6:1会促进形成多个插入。如果对DNA的浓度不确定，可以做不同比例的多个连接反应。 

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