顺乌头酸酶活性检测试剂盒 微量法

顺乌头酸酶（ACO）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC4485

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、试剂三：易挥发试剂，使用后尽快拧紧盖子，密封后放入-20℃保存；

产品说明：

顺乌头酸酶（Aconitase, ACO）是细胞内一种重要的铁硫蛋白酶，主要存在于胞浆与线粒体中。ACO催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸的可逆反应，对维持三羧酸循环及乙醛酸循环的顺利进行起着重要作用。

顺乌头酸酶催化异柠檬酸生成顺乌头酸，顺乌头酸在240nm有特征吸收峰，通过检测顺乌头酸的产生速率来计算该酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声波细胞破碎仪、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、顺乌头酸酶的提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

A、总顺乌头酸酶的提取

称取约0.1g组织或收集500万个细胞（细菌），加入1mL试剂一与10μL试剂三，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。将匀浆置于冰上超声波破碎（功率300W，超声3秒，间隔9秒，重复15次），4℃，11000×g离心15min，取上清置于冰上待测（若以蛋白浓度计算，则需留出足够量来测定蛋白浓度Cpr1）。用于测定总顺乌头酸酶活性（建议将样本用蒸馏水稀释4 -10倍后检测）。

B、胞浆与线粒体中顺乌头酸酶的提取

(1) 称取约0.2 g组织或收集1000万个细胞，加入1mL试剂一与10μL试剂三，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。

(2) 4℃，600×g离心5min。（若以蛋白浓度计算，则需留出足够量来测定蛋白浓度Cpr2）。

(3) 将上清液移至另一离心管中，4℃，11000×g离心15min。

(4) 上清液即胞浆提取物，用于测定胞浆中的顺乌头酸酶活性（建议将样本用蒸馏水稀释4 -10倍后检测）。

(5) 在沉淀中加入400μL试剂二与4μL试剂三，置于冰上超声波破碎（功300W，超声3秒，间隔9秒，重复15次），4℃，5000×g离心2min，取上清置于冰上待测。用于测定线粒体中顺乌头酸酶活性（建议将样本用蒸馏水稀释4 -10倍后检测）。

注意：根据实验需要选择性提取细胞总顺乌头酸酶、胞浆乌头酸酶或线粒体乌头酸酶。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至240nm，分光光度计用蒸馏水调零。

2. 样本测定

（1） 将试剂四25℃预热15min以上；

（2） 在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入：

三、顺乌头酸酶活性的计算

A、按微量石英比色皿计算：

1、总顺乌头酸酶活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每mg组织蛋白每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO酶活(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷(V样×Cpr1) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr1×N

（2） 按样本质量计算

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO酶活(U/g 质量)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷(V样÷V提取×W）÷T×N=561.11×ΔA÷W×N

（3） 按照细菌或细胞数量计算

酶活定义：每10⁴个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO酶活(U/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷（V样÷V提取×细胞数量（万个））÷T×N

=561.11×ΔA÷细胞数量（万个）×N

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：顺乌头酸消光系数，3.6 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V提取：样本总体积，1.01mL；T：反应时间，5min；Cpr1：样本蛋白质浓度，mg/mL；10⁶：单位换算系数，1mmol=1×10⁶nmol；N：稀释倍数；W：样本质量，g。

2、胞浆顺乌头酸酶活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每mg组织蛋白每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO酶活(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷(V样×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N

（2） 按样本质量计算

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO酶活(U/g 质量)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷(V样÷V提取×W）÷T×N=561.11×ΔA÷W×N

（3） 按照细菌或细胞数量计算

酶活定义：每10⁴个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO酶活(U/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷（V样÷V提取×细胞数量（万个））÷T×N

=561.11×ΔA÷细胞数量（万个）×N

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：顺乌头酸消光系数，3.6L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V提取：胞浆样本总体积，1.01mL；T：反应时间，5min；Cpr2：样本蛋白质浓度，mg/mL；10⁶：单位换算系数，1mmol=1×10⁶nmol；N：稀释倍数；W：样本质量，g。

3、线粒体顺乌头酸酶活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每mg组织蛋白每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO酶活(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁶]÷(V样×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N

（2）按样本质量计算

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO酶活（U/g 质量）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁶]÷(V样÷V样总×W）÷T×N=244.44×ΔA÷W×N

（3） 按照细菌或细胞数量计算

酶活定义：每10⁴个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产1 nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO酶活（U/10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁶]÷（V样÷V样总×细胞数量（万个）÷T×N

=244.44×ΔA÷细胞数量（万个）×N

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：顺乌头酸消光系数，3.6 L/mmol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V样总：线粒体样本总体积，0.404mL；T：反应时间，5min；Cpr2：样本蛋白质浓度，mg/mL；10⁶：单位换算系数，1mmol=1×10⁶nmol；N：稀释倍数；W：样本质量，g。

B、按96孔UV板计算：

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。

注意事项：

1、 A大于1时，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，并在计算时乘以相应的稀释倍数。

2、 当ΔA小于0.01时，可适当延长反应时间，并在计算时将实际反应时间（T）带入计算公式。

3、 测定蛋白浓度时，由于试剂一本身含有蛋白（约1 mg/mL）所有测定时需要扣除此部分蛋白。

实验实例：

1. 取0.1g画眉草样本，加入1mL试剂一与10μL试剂三进行总顺乌头酸酶的提取，取上清稀释4倍，用微量石英比色皿测得ΔA=A2-A1=0.5693-0.5571=0.0122，按样本质量计算总顺乌头酸酶的酶活得：

ACO酶活(U/g 质量)=561.11×ΔA÷W×N=273.8217 U/g 质量。

2. 取0.1g兔子肾脏样本，加入1mL试剂一与10μL试剂三进行总顺乌头酸酶的提取，取上清稀释8倍，用微量石英比色皿测得ΔA=A2-A1=0.4520-0.4186=0.0334，按样本质量计算总顺乌头酸酶的酶活得：

ACO酶活(U/g 质量)=561.11×ΔA÷W×N=1499.2859 U/g 质量。

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