蛋白质二硫键含量检测试剂盒 微量法

蛋白质二硫键含量检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5795

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 提取液配制：临用前根据样本量按照提取液一：提取液二=1mL：1 mL进行配制，勿一次性全部混合。

2、 若试剂二有析出，可置于37℃水浴加热至澄清透明后使用。

3、 标准品：10mg还原型谷*甘肽（GSH）。临用前加入1.3mL蒸馏水配制成25μmol/mL，2-8℃保存4周。

4、 0.125μmol/mL标准品配制：取50μL 25μmol/mL标准品，加入950μL蒸馏水，充分混匀，配制成1.25μmol/mL的标准品；然后取100μL 1.25μmol/mL标准品，加入900μL蒸馏水，充分混匀，配制成0.125μmol/mL的标准品使用，现配现用。

产品说明：

蛋白质是一类重要的生物大分子，存在于一切生物体内，是生命的基础物质。二硫键是连接不同肽链或同一肽链中，两个不同半胱氨*残基的巯基的化学键。二硫键对蛋白质的结构影响很大，在蛋白质分子中，起着稳定肽链空间结构的作用，所以测定蛋白质二硫键含量尤为重要。

还原剂会使二硫键裂解，裂解后的巯基会发生亲核反应，即巯基与5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在412nm处有最大吸收峰，据此可以计算蛋白质二硫键含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低温离心机、研钵/匀浆器、丙酮（AR）、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，3000rpm 离心10min，弃上清。在沉淀中加入2mL试剂一，搅匀后溶解沉淀，沉淀溶解液作为样本进行实验。（注：（1）植物叶片等纤维含量较高的样本，溶解沉淀后4℃ 3000rpm离心3min，取上清作为样本进行实验,；（2）加入试剂一后会有大量气泡产生，请缓慢加入，建议使用5mL的EP管）。

2. 细菌/细胞：按照细菌/细胞数量（10⁶个）：提取液体积（mL）为5~10：1的比例（建议5百万细菌/细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3秒，间隔10秒，总时间3min）后，于4℃，3000rpm 离心10min，弃上清。在沉淀中加入2mL试剂一，搅匀后溶解沉淀，沉淀溶解液作为样本进行实验。（注：（1）若沉淀溶解不全，可4℃ 3000rpm离心3min，取上清作为样本进行实验；（2）加入试剂一后会有大量气泡产生，请缓慢加入，建议使用5mL的EP管）。

3. 血清/血浆、牛奶等液体：取100μL液体样本加入0.9mL丙酮，4℃，3000rpm 离心10min，弃上清。在沉淀中加入2mL试剂一，搅匀后溶解沉淀，沉淀溶解液作为样本进行实验。（注：若测定数值偏小，可改变样本与丙酮的比例，如取0.2mL液体样本加入0.8mL丙酮或0.3mL液体样本加入0.7mL丙酮，注意同步修改计算公式）。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 操作表：（建议在2mL的EP管中操作）

三、蛋白质二硫键含量的计算

1. 按照样本蛋白浓度计算：

蛋白质二硫键含量（μmol/mg prot）=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V样本÷（V样本×Cpr）÷2×F

=0.0625× ΔA测定÷ΔA标准×Cpr×F

2. 按照样本质量计算：

蛋白质二硫键含量（μmol/g 质量）=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V试剂一÷W÷2×F

=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F

3. 按照液体体积计算：

蛋白质二硫键含量（μmol/mL）=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V试剂一÷V液样÷2×F

=1.25×ΔA测定÷ΔA标准×F

4. 按照细胞/细菌数量计算：

蛋白质二硫键含量（μmol /10⁶ cell）=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V试剂一÷N÷2×F
=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷N×F

C标准：标准管浓度，0.125μmol/mL；V样本：加入的样本体积，0.3mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定，可以使用BCA方法测定；W：样本质量，g；V试剂一：提取时加入试剂一体积，2mL；V液样：提取时加入的样本体积，0.1mL；2：一个二硫键裂解产生两个巯基；F：稀释倍数；N：细胞/细菌总数，以10⁶计。

注意事项：

1. 若样本Δ测定A<0.01，可适当增大样本量后测定，注意同步修改空白管和标准管及计算公式；若样本ΔA测定>1.5，可用试剂一稀释沉淀溶解液后测定，注意同步修改计算公式中的稀释倍数。

实验实例：

1、 取100μL马血清，按照测定步骤操作，用96孔板测得ΔA测定=（A2测定-A1测定）-（A2对照-A1对照）=（0.348-0.113）-（0.047-0.045）=0.233，ΔA标准=A标准-A空白=0.417-0.105=0.312，按样本液体体积计算蛋白质二硫键含量得：

蛋白质二硫键含量（μmol/mL）= 1.25×ΔA测定÷ΔA标准×F =0.933μmol/mL。

2、 取0.1036g鼠肝，按照测定步骤操作，用96孔板测得ΔA测定=（A2测定-A1测定）-（A2对照-A1对照）=（0.475-0.107）-（0.261-0.105）=0.212，ΔA标准=A标准-A空白=0.417-0.105=0.312，按样本质量计算蛋白质二硫键含量得：

蛋白质二硫键含量（μmol/g 质量）=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F =0.820μmol/g 质量。

3、 取0.1078g黄豆粉，沉淀溶解液用试剂一稀释2倍后，按照测定步骤操作，用96孔板测得ΔA测定=（A2测定-A1测定）-（A2对照-A1对照）=（0.762-0.084）-（0.123-0.070）=0.625，ΔA标准=A标准-A空白=0.417-0.105=0.312，按样本质量计算蛋白质二硫键含量得：

蛋白质二硫键含量（μmol/g 质量）=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F =4.646μmol/g 质量。

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