甲基柠檬酸合酶活性检测试剂盒 微量法

甲基柠檬酸合酶（MCS）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5865

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂四：临用前加入0.5mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

2、 试剂五：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

产品说明：

甲基柠檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，与柠檬酸合酶（CS）共同参与三羧酸循环的调节。

MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸产生甲基柠檬酰*A，进一步水解产生甲基柠檬酸；该反应促使DTNB转变成黄色的TNB，在412nm处有特征吸收峰，据此可以计算MCS活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）和10μL试剂一，进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。

2. 细菌/细胞：按照细菌/细胞数量（10⁶个）：提取液体积（mL）为5~10：1的比例（建议5百万细菌/细胞加入1mL提取液和10μL试剂一），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3秒，间隔7秒，总时间5min）；然后12000 g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计用蒸馏水调零。

2、 试剂二置于37℃水浴中预热15min。

3、 操作表：在微量比色皿/96孔板中依次加入（适用于测定动物组织样本）

4、 操作表：在微量比色皿/96孔板中分别加入（适用于测定微生物及植物组织样本）

三、甲基柠檬酸合酶（MCS）计算公式

1. 使用96孔板测定（动物组织样本）：

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（Cpr×V样）÷T=700.28×ΔA÷Cpr

（2）按样本质量计算：

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（W÷V提取×V样）÷T=707.28×ΔA÷W

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光径，0.6cm；V反：反应体系体积，0.2mL； V样：反应体系中加入的样本体积，0.007mL；V提取：加入提取液及试剂一的体积，1.01mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

2. 使用96孔板测定（微生物及植物组织样本）：

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（Cpr×V样）÷T=20.42×ΔA÷Cpr

（2）按样本质量计算：

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（W÷V提取×V样）÷T=20.63×ΔA÷W

（3）按细菌/细胞计算：

酶活定义：每10⁶个细菌/细胞在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（N÷V提取×V样）÷T = 20.63×ΔA÷N

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光径，0.6cm；V反：反应体系体积，0.2mL； V样：反应体系中加入的样本体积，0.040mL；V提取：加入提取液及试剂一的体积，1.01mL；T：反应时间，30min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以10⁶计。

3. 使用微量比色皿测定：

将上述公式中的d=0.6cm改为d=1cm（微量比色皿光径）进行计算即可。

注意事项：

1. 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

2. 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

3. 由于提取液含有蛋白成分（约1mg/mL），故测定蛋白浓度时需要同时测定提取液的蛋白浓度。

4. 当样本ΔA＜0.01时，可适当延长酶促反应时间或增大样本量后测定，注意同步修改计算公式。

5. 当样本ΔA>1或A>1.5时，可将样本用提取液适当稀释后测定，注意同步修改计算公式。

实验实例：

1、 取0.0918g小鼠心脏加入1mL提取液和10μL试剂一进行冰浴匀浆，取上清用后，按照测定步骤操作，用96孔板测得ΔA=（A2测定-A1测定）-（A2对照-A1对照）=（0.665-0.349）-（0.261-0.251）=0.306，按样本质量计算MCS活性得：

MCS活性（U/g 质量）= 707.28×ΔA÷W =2357.60 U/g 质量。

2、 取0.1186g霉菌加入1mL提取液和10μL试剂一进行冰浴匀浆，取上清后按照测定步骤操作，用96孔板测得ΔA=（A2测定-A1测定）-（A2对照-A1对照）=（0.362-0.262）-（0.255-0.261）=0.106，按样本质量计算MCS活性得：

MCS活性（U/g 质量）= 20.63×ΔA÷W =18.72 U/g 质量。

3、 取0.1013g竹叶加入1mL提取液和10μL试剂一进行冰浴匀浆，取上清后按照测定步骤操作，用96孔板测得ΔA=（A2测定-A1测定）-（A2对照-A1对照）=（0.291-0.252）-（0.261-0.249）=0.027，按样本质量计算MCS活性得：

MCS活性（U/g 质量）=20.63×ΔA÷W =5.50 U/g 质量。

参考文献：

[1] Maerker, C, et al. "Methylcitrate synthase from Aspergillus fumigatus. Propionyl-CoA affects polyketide synthesis, growth and morphology of conidia. " Febs Journal 272.14(2010):3615-3630.

[2] Watson, D., Lindel, D.L. & Fall, R. Pseudomonas aeruginosa contains an inducible methylcitrate synthase. Current Microbiology 8, 17–21 (1983).

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