精*酸（Arg）含量检测试剂盒 微量法

精*酸（Arg）含量检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5635

规格：100T/96S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前加入0.6mL无水乙醇，充分溶解。-20℃可以保存4周。

2、 工作液配制：按照试剂一︰试剂二=10μL：90μL（100μL，2T）的比例配制，根据样本量现配现用。

3、 标准品：临用前加入0.918mL蒸馏水，充分溶解，配制成62.5 μmol/mL 精*酸标准溶液。临用前取10μL的62.5 μmol/mL 精*酸标准溶液于EP管中，加入790 μL蒸馏水充分溶解，配制成0.78125 μmol/mL的精*酸标准溶液。

产品说明：

精*酸(Arginine)是人体和动物体内的半必需氨基酸，在机体中参与蛋白质的合成代谢、以及多胺和NO的合成，起着重要的生理作用。精*酸有降低血压的作用，在体内精*酸能够分解成为一氧化氮，一氧化氮能松弛血管壁平滑肌，调节血管弹性，对血管内膜有修复作用。精*酸能够刺激并诱导肾上腺激素分泌，从而降低血糖，减少身体中脂肪酸的生产，能使高血糖患者的血糖降至正常水平。

精*酸在碱性介质中与甲萘酚和次氯酸钠生成红色生成物，其在525nm处有特征吸收峰，以此计算精*酸含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、涡旋混匀仪、分析天平、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、蒸馏水、无水乙醇和冰。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

细胞：按照细胞数量（10⁶个）：提取液一体积（mL）为5~1：1的比例（建议5百万细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

血清（浆）等液体：取100μL液体加入1mL提取液一，4℃ 12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

注：提取液二需缓慢加入，加入后会产生大量气泡，建议使用2mL EP管进行操作。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至525nm，分光光度计用蒸馏水调零。

2、 在1.5mL EP管或96孔板中按下表步骤加样：

三、精*酸（Arg）含量计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

Arg含量（μmol/mg prot）=C_标准×∆A_测定÷∆A_标准×V_样÷（Cpr×V_样）×F=0.781×∆A_测定÷∆A_标准÷Cpr×F

(2) 按样本质量计算

Arg含量（μmol/g 质量）= C_标准×∆A_测定÷∆A_标准×（V_上清+V_提取液二）÷（W×V_上清÷V_提取液一）×F

= 0.928×∆A_测定÷∆A_标准÷W×F

(3) 按细菌或细胞数量计算

Arg含量（μmol/10⁶ cell）= C_标准×∆A_测定÷∆A_标准×（V_上清+V_提取液二）÷（N÷V_上清÷V_提取液一）×F
= 0.928×∆A_测定÷∆A_标准÷N×F

(4) 按液体体积计算

Arg含量（μmol/mL）= C_标准×∆A_测定÷∆A_标准×（V_上清+V_提取液二）÷（V_液体×V_上清÷（V_液体+V_提取液一））×F

= 10.205×∆A_测定÷∆A_标准×F

C_标准：精*酸标准溶液浓度，0.78125μmol/mL；V_样：反应体系中加入的样本体积，0.05mL；V_上清：提取时上清的体积，0.8mL；V_提取液二：加入提取液二的体积，0.15mL；V_提取液一：加入提取液一的体积，1mL；V_液体：液体样本体积，0.1mL；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞或细菌数量，以10⁶计；F：样本稀释倍数。.

注意事项：

1. 如果∆A_测定大于1.2，可以用蒸馏水对样本进行稀释；如果∆A_测定过小，可以加大样本量。最终计算时同步修改计算公式。

2. 提取液一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取组织。

实验实例：

1、 称取0.1162g小鼠肾脏组织，加入提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算∆A_测定=A_测定-A_空白=0.524-0.232=0.292，∆A_标准=A_标准-A_空白=0.575-0.232=0.343，带入公式计算：

Arg含量（μmol/g 质量）=0.928×∆A_测定÷∆A_标准÷W=6.799 μmol/g 质量

2、 称取0.1186g花生组织，加入提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算∆A_测定=A_测定-A_空白=0.556-0.232=0.324，∆A_标准=A_标准-A_空白=0.575-0.232=0.343，带入公式计算：

Arg含量（μmol/g 质量）=0.928×∆A_测定÷∆A_标准÷W=7.391 μmol/g 质量

3、 取人血清按按前处理和实验步骤进行实验，用96孔板测得计算∆A_测定=A_测定-A_空白=0.3-0.232=0.068，∆A_标准=A_标准-A_空白=0.575-0.232=0.343，带入公式计算：

Arg含量（μmol/mL）=10.205×∆A_测定÷∆A_标准×F =2.023 μmol/mL。

参考文献：

[1] Francis P S, Barnett N W, Foitzik R C, et al. Chemiluminescence from the Sakaguchi reaction [J]. Analytical Biochemistry, 2004, 329(2):340-341.

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