游离血红蛋白（FHb）含量检测试剂盒 其它

游离血红蛋白（FHb）含量检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC5590

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 工作液：临用前根据样本量按照试剂一：试剂二：试剂三=500μL：500μL：25μL（1.025mL，约1T）的比例配制工作液，现用现配。

2. 标准品：5mg血红蛋白，临用前加入1mL蒸馏水，充分混匀，配制成5mg/mL标准液，2-8℃可保存4周。

产品说明：

血管内发生溶血时，红细胞破裂，释放出血红蛋白，血浆中游离血红蛋白（free hemoglobin，FHb）增多。自身免疫性溶血性贫血、镰刀型细胞贫血、珠蛋白生成障碍性贫血患者血浆FHb有轻度至中度增加，阵发性睡眠性血红蛋白尿症、阵发性严寒性血红蛋白尿症、不稳定血红蛋白病等会出现血尿症状。因此，血浆中FHb的测定对于临床诊断溶血性疾病有重要作用。

血红蛋白中的亚铁血红素有类似过氧化物酶的催化活性，能够催化过氧化氢氧化4-氨基安*比林和苯胺类似物，生成紫色化合物，其在546nm有特征吸收峰，其颜色深浅与FHb含量成正比。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理

血浆等液体：直接测定。若有浑浊请离心后取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至546nm，蒸馏水调零。

2、 标准溶液的稀释：将5mg/mL（5000mg/L）血红蛋白标准液用蒸馏水进行稀释得到156.25、78.125、39.063、19.531、9.766、4.883mg/L的标准溶液备用。

3、 标准溶液稀释可参考下表：

备注：实验中每个标准管需60µL标准溶液。

4、 将工作液37℃预热15min。

5、 在1mL玻璃比色皿中按下表步骤加样：

三、游离血红蛋白（FHb）含量计算

1. 标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x，mg/L）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，mg/L）。

2. FHb含量的计算：

游离血红蛋白（FHb）含量（mg/L）=x×F

F：样本稀释倍数。

注意事项：

1. 若测定血浆样本，采样和分离血浆过程中避免发生溶血。

2. 若样本测定管吸光值A测定＞1，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。

3. 若样本测定管吸光值A测定＜0.01或接近空白管吸光值，建议将样本加样量增大后再进行测定，空白管和标准管加样量也需进行相应调整。

实验实例：

1. 取60µL兔血清样本，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A测定-A空白= 0.216-0.064= 0.152，根据标准曲线y=0.007x-0.0075，R²=0.9981。计算x=22.786，计算FHb含量得：

游离血红蛋白（FHb）含量（mg/L）=x×F=22.786 mg/L。

2. 取60µL马血清样本，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A测定-A空白= 0.166-0.064= 0.102，根据标准曲线y=0.007x-0.0075，R²=0.9981。计算x=15.643，计算FHb含量得：

游离血红蛋白（FHb）含量（mg/L）=x×F=15.643 mg/L。

参考文献：

[1] Reeder B, Svistun enko D, Cooper C, et al. The radical and redox chemistry of myoglobin and hemoglobin: from in vitro studies to human pathology [J]. Antioxid Redox Signal, 2004, 6(6): 954-966.

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